NF-κB在胃癌组织中的表达与临床病理的相关性研究

赵 煜 曾 杰

四川省人民医院急诊外科，四川成都 610072

我国胃癌的新发病例数和胃癌死亡率居恶性肿瘤之首，其发生、发展机制尚未完全明确。大约65%胃癌患者确诊时已经出现局部或远处转移[1]。 故侵袭与转移的机制成为胃癌研究的重要方向， 研究显示，细胞信号转导在肿瘤的发生、发展中起重要作用[2]。 NFκB 是一种细胞核内信号转导的重要因子， 活化的NF-κB 能靶向调控肿瘤相关基因的转录[3]。NF-κB 与肿瘤发生发展关系密切， 但与胃癌的关系研究不多。我们通过免疫组化法分析NF-κB 在胃癌组织中的表达，探讨其作为判断胃癌预后指标的临床意义，现将材料归纳如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2004 年1 月～2009 年1 月四川省人民医院病理科收治的50 例胃癌根治标本， 其中男38 例，女12 例，年龄30～78 岁；高、中分化23 例，低、未分化27例；有淋巴结转移32 例，无淋巴结转移18 例；肿瘤直径≥5 cm 者33 例，＜5 cm 者17 例； 患者术前均未接受放疗和化疗。 另取同期50 例非肿瘤患者胃黏膜组织作为对照，其中男35 例，女15 例，年龄30～75 岁。所有患者性别、年龄等一般资料比较差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。

1.2 实验材料

RAW 264.7 细胞株（中国科学院上海细胞所产品）；重组质粒NF-κB 荧光素酶（NF-κB-LUC）（美国国立癌症研究所提供）；Lipofectamine 2000 转染试剂（美国Invitmgen 公司产品）；荧光素酶分析试剂（美国Promega公司产品）兔抗大鼠NF-κB p65 抗体一抗（武汉博士德）。 SA-1022 山羊抗兔IgG 二抗SABC 免疫组化试剂盒（武汉博士德）；核-胞浆蛋白制备试剂盒（Pierce公司）。

1.3 检测方法

1.3.1 标本处理 RAW 264.7 细胞在37℃、5%CO2的条件下，在含10%小牛血清的RPMI 1640 培养基（GIBCO-BRL）中贴壁生长。用Lipofectamine 2000 介导NFκB-LUC 质粒转染RAW 264.7 细胞。首先采集两组研究对象的静脉血标本，采集量为80 mL，分别取4.0 mL置于乙二胺四乙酸（EDTA）试管及BD 试管。将EDTA试管中血液样本进行处理，以PBS 液进行混合，再以淋巴细胞液加入并离心，3500 r/min， 离心15 min，取上清液进行检测，去沉淀物，然后以核-胞浆蛋白制备试剂盒进行检测，依次再进行细胞胞浆提取液（CERI）加入、震荡、冰浴，再进行CERI 加入、震荡、冰浴及离心，取胞浆冷藏，沉淀层反复进行上述处理4 次，后离心进行上清液冷藏。

1.3.2 组织芯片的制备及免疫组化染色处理 由两名资深病理科医师进行相应的处理，将空白石蜡芯片放入组织，然后以鼠组织定位，并连续切片，后贴在载玻片上以HE 染色进行对照。 以SP 免疫组化染色试剂盒及DAB 酶底物显色剂对标本进行染色处理， 严格按照说明书进行操作。

1.3.3 判断标准NF-κB 主要在细胞浆内阳性表达，颜色成棕黄色。 每张切片随机选取10 个视野（400 倍镜下）,每个视野下计数100 个细胞。另以阳性细胞所在比例≥40%和＜40%分别表示高表达和低表达。

1.4 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析， 计数资料用率表示， 组间比较采用χ2检验， 等级资料用Spearman 等级相关分析，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 胃癌组织、 癌旁组织和非肿瘤患者胃黏膜组织中NF-κB 的表达比较

胃癌组织、癌旁组织和非肿瘤患者胃黏膜组织中NF-κB 蛋白的表达, 表达阳性率分别为76.0%（38/50）、4.0%（2/50）和16.0%（8/50），三者相比差异均有统计学意义（P ＜0.05）。其中，胃癌组织与癌旁组织比较差异有统计学意义（χ2=20.404，P=0.000）；胃癌组织与正常胃黏膜组织比较差异有统计学意义 （χ2=43.51l，P=0.000）；癌旁组织与正常胃黏膜组织比较差异有统计学意义（χ2=6.655，P=0.010）。 见图1（封三）。

图1 不同胃黏膜组织中NF-κB 的表达（SP 染色，400×）

2.2 NF-κB 表达与胃癌患者临床病理特征关系的比较

50 例胃癌组织中NF-κB 的表达与脉管侵犯呈正相关（r=0.318，P=0.002），与淋巴结转移呈正相关（r=0.243，P=0.035），当肿瘤直径＜5 cm 时，与肿瘤大小呈正相关（r=0.315，P=0.002），与浸润程度呈正相关（r=0.350，P=0.001），与分化程度无相关性（r=0.119，P=0.242）。不同淋巴结转移、浸润程度、脉管侵犯情况的胃癌患者NF-κB 阳性表达例数比较， 差异均有统计学意义（P ＜0.05）。 见表1。

2.3 不同NF-κB 表达情况者5 年生存率比较分析

研究显示，胃癌组织低表达的16 例患者中，达到5 年生存率的占68.75%（11/16），高表达的22 例患者中， 达到5 年生存率的占27.27%（6/22） NF-κB 低表达者的5 年生存率显著高于高表达者（χ2=14.642，P ＜0.05），5 年生存率与NF-κB 表达关系分析结果显示5 年生存率与NF-κB 表达呈负相关 （r=-0.337，P=0.003）。

3 讨论

越来越多的证据表明，NF-κB 与肿瘤的发生有密切的关系，目前已证明在乳腺癌、甲状腺癌、T 或B淋巴细胞白血病、 结肠癌及几种病毒诱导的肿瘤中，均存在NF-κB 活性高表达[5-7]。 胃腺癌在男性常见癌症中位于第4 位，在女性中为第5 位，并且与慢性炎症密切相关[8]。 目前普遍认为幽门螺杆菌在胃炎到胃癌的恶性转化过程中发挥重要作用， 但仅有约l%感染人群最终转变为胃癌[9]。 这种差异的出现可能是因为受到局部炎症因子的遗传易感性的影响。幽门螺杆菌是慢性胃炎的主要病因，亦是第一类致胃癌因子[10]。幽门螺杆菌感染后，患者内皮细胞上的多种与癌通道受到影响，导致癌症的发生，而这些受影响的指标即有NF-κB。 NF-κB 表达与胃癌发生的关系，目前报道较少，观点也不一致。 研究发现幽门螺杆菌可以激活NF-κB，从而进一步导致胃癌的发生[11-12]。NF-κB 是一种能与免疫球蛋白κ 轻链基因增强子κB 序列特异性结合并调节其转录活性的核蛋白因子，其活化形式通常指NF-κB p65。 NF-κB 调控的基因参与了肿瘤的发生、血管生成和癌细胞的转移，同时NF-κB 基因产物异常表达会导致肿瘤的发生[13]。NF-κB 在肿瘤中的异常状态与癌细胞的凋亡密切相关， 而TLR4/NFκB 又与炎性及免疫应激有一定的关系， 通过通路与抗炎免疫机制密切相关，该通路的MYD 88 依赖和非依赖两条途径发挥作用， 形成相辅相承的信号转导过程[14]。 TLR4 受体的激活所需的四种蛋白又与上述指标相关，并对炎症细胞，尤其是促炎细胞产生影响，对其表达状态产生一定的影响作用[15]。 相关研究认为，NF-κB p65 对于胃癌的早期诊断有较高的价值，主要与其在此类患者早期组织中的表达状态有关，且其表达越高则患者生存率越高[16]，另外其与患者治疗后的生存期也密切相关，因此临床认为可将其作为胃癌预后的重要了解及监测指标[17]。有研究表明NF-κB转录因子亚单位的结合位点在TFF3 的5′端区域。TFF3 可通过IKK 短暂激活NF-κB 的炎性应激反应，并进一步影响Twist 蛋白，两者相互抑制，从而抑制炎症及肿瘤发生发展的过程[18-19]。

表1 胃癌组织临床病理特征与NF-κB 的表达的关系（例，n=50）

本实验采用免疫组化法检测了胃癌组织和癌旁肺组织中NF-κB 的表达，结果提示，在胃癌组织中，NF-κB 阳性表达明显高于癌旁组织， 提示NF-κB 表达可能与胃癌发生有关。 本实验还发现NF-κB 表达阳性率越高，淋巴转移率越高，预后也越差。有针对性地选择其活化途径的不同水平层次进行选择性调控NF-κB 的活性，可以从基因水平上防治胃癌，是抗癌药物设计的一个很好的靶点，为临床治疗胃癌提供一条新的途径。 NF-κB 是一种多项多功能核转录因子，其调节许多重要的生理过程，包括细胞生长、凋亡和肿瘤形成，同时可能影响肿瘤的血管形成，促进肿瘤的生长浸润和转移[20]。 本研究结果显示NF-κB 的表达与脉管侵犯，淋巴结转移、肿瘤大小呈正相关，与分化程度无相关性。

综上所述，NF-κB 阳性表达与胃癌的侵袭、转移密切相关， 检测NF-κB 的表达对胃癌病情监测及转移潜能及预后估计等方面有重要参考价值。

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