局部44℃温热治疗尖锐湿疣的效果及对外周血CD4+CD25+Foxp3+调节性T细胞及相关因子的影响

陈卫丰

湖南省益阳市中心医院皮肤科，湖南益阳 413000

CD4+CD25+调节性T 细胞（Treg 细胞）对机体发挥免疫调节功能方面起非常重要的作用，如维持免疫自稳、调控免疫应答等。 研究表明，由人类乳头瘤病毒（HPV）引起的尖锐湿疣（CA）与其细胞免疫功能相对不足密切相关，CD4+CD25+Treg 细胞调控机体对病毒感染的免疫应答主要通过抑制效应细胞的增殖和抑制细胞因子分泌，CD4+CD25+FOXP3+Treg 细胞的局部聚集可能是皮损的CA 实现免疫逃逸的机制之一[1]。近年来，局部的44℃温热治疗被成功地应用于不同型别的HPV 感染，可能通过促进朗格汉斯细胞（LC）的迁移和成熟，在局部细胞免疫应答中发挥作用[2]。本研究通过动态检测35 例CA 患者在44℃温热治疗前后CD4+CD25+Treg 的表达及在调节性T 细胞分化发育和功能维持中起重要作用的转录因子Foxp3 以及负性协同刺激分子，如程序性死亡分子配体（PD-L）、细胞毒T 细胞相关抗原4（CTLA-4）和肿瘤坏死因子受体（GITR）等的表达水平，以及CD4+CD25+Treg 细胞内分泌的抑制性细胞因子白介素-10（IL-10）和转化生长因子-β（TGF-β）的阳性细胞百分比，探讨44℃温热对CA 患者机体免疫功能的影响及可能作用机制，为温热治疗尖锐湿疣提供新的理论依据和新的治疗靶点。

1 对象与方法

1.1 对象

选取2013 年1 月～2015 年4 月益阳市中心医院皮肤科门诊就诊的经临床确诊的CA 患者35 例，均无复发性CA 病史，35 例受试者疣体数目≥5 个或单个直径≥2 cm，符合2000 年原卫生部防疫司制订的CA 诊断标准[3]，其中男15 例，女20 例；年龄18～60 岁，平均（37.45±10.58）岁；病程0.1～30 个月，平均（9.63±3.51）个月。 选取正常人作为对照组，共35 例，其中男17 例，女18 例，年龄18～58 岁，平均（30.78±9.41）岁。所有研究对象近2 个月内没有使用过任何免疫调节的相关药物，排除全身衰竭、结核、肝肾疾病、肿瘤、器官移植及其他免疫性疾病。 各组间年龄、性别差异无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。所有标本的收集均经其本人或家属同意并签署知情同意书。

1.2 治疗方法

应用中国医科大学自主研制的温热治疗仪（专利号ZL200720185403.3），选取靶疣进行局部44℃温热治疗，连续治疗4 d，每次60 min，1 次/d；间隔7～10 d，再连续治疗3 d；间隔7～10 d，再连续治疗2 d；此后每隔7～10 d 进行1 次治疗，直至疣体消退。 3 个月时观察临床疗效。

1.3 研究方法

1.3.1 试剂和仪器 CD4-FITC 单克隆鼠抗人抗体，CD25-PE 单克隆鼠抗人抗体及同型对照IgG1-FITC，IgG1-PE，PD-L-FITC单克隆鼠抗人抗体、CTLA-4（CD152）-PE 单克隆鼠抗人抗体及同型对照小鼠IgG1、IgG2α抗 体 和PE 标 记 的 抗 人Foxp3 胞 内 染 色 试剂盒均购自eBioscience 公司。 流式细胞仪为Beckman公司产品（型号：EPICS-XL）。 人IL-10、人TGF-β1酶联免疫吸附测定（ELISA）试剂盒为eBiosource 公司产品。淋巴细胞分离液（AXIS-SHIELD 公司）。MagCellectTM人CD4+CD25+Treg 细胞免疫磁珠分选试剂盒购自R&D 公司。

1.3.2 CD4+CD25+T 细胞的分离纯化 用90 μL 缓冲液调整外周血单个核细胞（PBMC）为1×108/mL，再加入CD25 磁珠标记抗人CD25 单抗10 μL，置4℃冰箱孵育15 min，过MS 柱分选，收集流下来的细胞悬液和洗柱液，阳性选择获得CD4+CD25+Treg 细胞，重复上述操作，以增加细胞的纯度。经流式细胞仪分析，其纯度＞85%。

1.3.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞染色 采用淋巴细胞分离液（AXIS-SHIELD 公司）经密度梯度离心法分离外周血单个核细胞，用含10%的小牛血清的培养基RPMI 1640 调细胞至1×106/mL，取200 μL 细胞悬液加入抗CD4-PE、CD25-FITC 单克隆抗体各20 μL，同型对照分别为IgG1-FITC，IgG1-PE，混匀，室温避光孵育20～30 min，加2 mL 磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤2 次，4℃，1500 r/min 离心5 min，弃上清，加2%正常大鼠血清100 μL，避光封闭20 min，以减少非特异性荧光吸附，再加入PE 标记抗人Foxp3 抗体10 μL，避光孵育20～30 min，加2 mL PBS 缓冲液洗涤2 次，将细胞悬浮于0.5 mL PBS 洗涤液中，振荡混匀后上机检测。1.3.4 CD4+CD25+Treg 细胞膜分子荧光染色 采用全血荧光抗体直接染色法[3]，取2 管EDTA 抗凝全血100 μL，置12 mm×75 mm 专用塑料试管中， 加入20 μL 特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作为同型对照，室温下避光染色15 min。 然后加入溶血素2 mL 溶解红细胞、稳定和固定白细胞，静置5 min，4℃，1500 r/min 离心5 min，弃上清，用PBS 洗涤2 次，最后加入1%多聚甲醛300 μL 固定后上机检测。

1.3.5 CD4+CD25+Treg 细胞内细胞因子IL-10 和TGF-β 的检测 具体方法参见文献[4]：取上述冻存PBMC 培养上清， 采用ELISA 法检测上清中IL-10和TGF-β 水平，按试剂盒提供的说明书进行操作。

1.4 疗效标准

治愈：外阴尖锐湿疣疣体全部脱落，临床症状消失，宫颈HPV-DNA 复查结果为阴性。 显效：宫颈HPV-DNA 复查结果为阴性或弱阳性，外阴尖锐湿疣疣体脱落70%以上。 无效：HPV-DNA 复查结果为阳性或强阳性，外阴尖锐湿疣疣体无改变或无明显脱落。总有效率=（治愈例数+显效例数）/总例数×100%。 以3 个月为治疗终点，计算总有效率。

1.5 统计学方法

采用SPSS 16.0 统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（±s）表示，两组间比较采用t 检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验，以P ＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

CA 患者经局部44℃温热治疗3 个月后，总有效率达85.71%（30/35），治疗中未见明显副作用。

2.1 两组外周血CD4+CD25+Treg 细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞、抑制性膜分子和细胞因子表达水平的比较

CA 组患者CD4+CD25+Treg 细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L 表达水平均显著高于对照组（均P ＜0.05）；CA 组患者IL-10及TGF-β 的阳性细胞数比对照组明显增多（均P ＜0.05）。见表1。

表1 两组外周血CD4+CD25+Treg 细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞、抑制性分子和细胞因子表达水平比较（±s）

表1 两组外周血CD4+CD25+Treg 细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞、抑制性分子和细胞因子表达水平比较（±s）

注：CA：尖锐湿疣；CTLA-4：细胞毒性T 淋巴细胞抗原4；GITR：肿瘤坏死因子受体；PD-L：程序性死亡分子1 配体；IL-10：白细胞介素-10；TGF-β：转化生长因子-β

组别 例数 CD4+CD25+Treg 细胞（%） CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞（%） CTLA-4 GITR PD-L IL-10 TGF-β对照组CA 组t 值P 值35 35 10.5±1.8 15.2±2.3 9.52＜0.05 5.8±1.4 13.1±2.5 15.07＜0.05 1.2±0.4 3.2±1.3 8.63＜0.05 8.6±1.6 13.2±2.5 9.16＜0.05 1.4±0.5 2.3±0.9 10.92＜0.05 0.47±0.13 0.60±0.20 3.22＜0.05 0.15±0.06 0.32±0.13 7.02＜0.05

2.2 治疗前后CA 患者外周血CD4+CD25+Treg 细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞、抑制性膜分子和细胞因子表达水平比较

治疗后外周血CD4+CD25+Treg 细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞、CTLA-4、GITR、PD-L 水平及IL-10、TGF-β 阳性细胞数较治疗前显著下降（均P ＜0.05）。见表2。

3 讨论

大量研究表明，免疫系统在人乳头瘤病毒引起的相关疾病结局上起重要作用，HPV 持续感染的重要机制是全身或局部细胞免疫功能缺陷，病损局部主要组织相容性复合体（MHC）Ⅰ和MHCⅡ分子的下调，导致恶性变[1-4]。近年随着对CD4+CD25+Treg 各种生物学特性和功能的进一步研究，CD4+CD25+Treg 细胞表面表达CD25、CTLA-4、GITR 和PD-L 等膜分子，其特征性的分子标记是Foxp3+，发现HPV 感染很可能存在Treg 异常，如HPV 病损局部可有CD4+CD25+Foxp3+Treg 高表达，也不具有MHC 限制性，主要通过细胞间直接接触和分泌抑制性膜分子IL-10 和TGF-β 发挥免疫抑制功能，免疫抑制环境主要由局部低表达细胞因子IL-2、IFN-γ 和TGF-β、IL-10 高表达形成。CD4+CD25+Treg 细胞是一种新型免疫抑制调节细胞，机体对病毒感染的免疫应答主要通过抑制增殖效应细胞和分泌细胞因子来调控，CD4+CD25+Treg 细胞免疫抑制效应可能在CA 的发病机制中发挥重要作用[5]，提示刺激HPV 发生特异性免疫反应可通过抑制或去除Treg 细胞来达成，从而抑制HPV 的持续慢性感染。随着热疗技术的相关原理研究进一步深入，以及对温度测定、控制和加热技术的不断进步，热疗技术在临床上得到了广泛的应用。 近年来，温热被广泛应用于各种病毒疣的治疗，并且取得了良好的疗效，但其具体的作用机制尚不明了[6-7]。 有研究表明，44℃温热能够促进LC 成熟、迁移，并且增强其抗原提呈能力，LC能通过真皮层向局部淋巴结迁移，诱导病毒疣局部细胞发生免疫应答，从而对病毒感染引起的病毒疣发挥有效作用[8-9]。

表2 治疗前后CA 患者外周血CD4+CD25+T 细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞、抑制性分子及细胞因子表达水平比较（±s）

表2 治疗前后CA 患者外周血CD4+CD25+T 细胞、CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞、抑制性分子及细胞因子表达水平比较（±s）

注：CA：尖锐湿疣；CTLA-4：细胞毒性T 淋巴细胞抗原4；GITR：肿瘤坏死因子受体；PD-L：程序性死亡分子1 配体；IL-10：白细胞介素-10；TGF-β：转化生长因子-β

时间 例数 CD4+CD25+Treg 细胞（%） CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞（%） CTLA-4 GITR PD-L IL-10 TGF-β治疗前治疗后t 值P 值35 35 15.2±2.3 11.2±2.0 7.76＜0.05 13.1±2.5 6.5±1.7 12.91＜0.05 3.2±1.3 1.4±0.5 7.46＜0.05 13.2±2.5 9.2±1.8 7.68＜0.05 2.3±0.9 1.6±0.6 9.29＜0.05 0.60±0.20 0.50±0.10 2.64＜0.05 0.32±0.13 0.17±0.07 6.01＜0.05

本研究结果表明，CA 患者CD4+CD25+Treg 细胞、 转录因子Foxp3+及抑制性膜分子CTLA-4、GITR、PD-L 表达均比对照组显著增高 （P ＜0.05）；CA 组CD4+CD25+T 细胞内分泌IL-10 及TGF-β 的阳性细胞数比对照组明显增多， 说明机体免疫功能受到明显抑制，CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞及相关因子共同参与了尖锐湿疣的发生发展，CA 患者高表达CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞数，可诱导其增殖活化，同时高表达转导抑制信号的负性协同刺激分子CTLA-4、GITR 及PD-L， 其表达水平可以反映Treg 细胞功能的强弱，通过某种机制抑制机体免疫功能的影响，这在尖锐湿疣发病机制中起重要作用[10]。 也有学者指出，Treg 细胞可以通过直接接触和分泌抑制性因子IL-10及TGF-β 发挥免疫抑制和感染耐受的双重作用[11]。尖锐湿疣发生及持续感染的重要机制之一在于机体不能产生有效的免疫保护作用[12]，CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞通过抑制CD4+和CD8+细胞的IL-2 基因转录和表达来抑制T 细胞的活化增殖， 使局部微环境处于免疫抑制或耐受状态，Foxp3+Treg 细胞通过TGF-β 在促进自身增殖分化同时抑制Th1和Th2分化，从反向抑制了机体局部抗病毒免疫应答[13]，形成尖锐湿疣持续感染， 促进了尖锐湿疣生长和发展。有研究表明，CA 患者外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞含量明显增高，且复发患者显著高于初发患者，提示尖锐湿疣患者存在有一定程度上病毒特异性细胞免疫受损， 而细胞免疫功能水平直接影响尖锐湿疣HPV 感染的病程及其疾病的转归，通过抑制或去除Treg 细胞来刺激HPV 特异性免疫反应，从而抑制HPV慢性感染[14]。 局部44℃温热治疗3 个月，治愈率达85.71%， 治疗中未见明显副作用， 外周血CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞数量、CTLA-4、GITR、PD-L、IL-10 和TGF-β 水平显著下降（P ＜0.05），表明温热能够有效治疗HPV 感染尖锐湿疣病，这可能与协助增强机体免疫功能有关。 温热治疗疣体的说法不一，有些研究者认为病灶组织与正常组织相比， 对温热更敏感[15]，热损伤后更不易恢复[16]，有些则推测可能是温热引起病变组织坏死。 研究发现，44℃温热治疗尖锐湿疣病后， 机体可抑制CD4+CD25+Treg 细胞增殖活化，负性调节刺激分子CTLA-4、GITR、PD-L 以及抑制性细胞因子IL-10、TGF-β，推测其机制可能为促进了局部免疫调节作用，引起靶疣局部LC 向附近淋巴结迁移和增强抗原提呈功能，从而促成特异性免疫应答的建立， 破除由局部高表达IL-10 和TGF-β 形成的免疫抑制环境，抑制免疫逃逸机制以清除HPV 病毒[2，17]。

综上所述，本研究认为，44℃温热治疗尖锐湿疣具有较好的临床疗效，能有效调节机体的免疫功能，其治疗机制可能与调节CD4+CD25+Foxp3+Treg 细胞及相关分子有关，值得临床进一步推广应用。

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