动脉粥样硬化靶向适配子的亲和力筛选

钟文飞等

[摘要] 目的 筛选动脉粥样硬化高亲和力适配子，为动脉粥样硬化靶向引导物的体内应用提供实验基础。 方法 将前期研究获得的一组巨噬细胞源性泡沫细胞适配子中的12个适配子进行生物素标记，采用酶联寡聚核苷酸吸附试验（ELONA）方法测定其亲和力（Kd），采用高脂方法建立载脂蛋白E基因敲除（ApoE-/-）动脉粥样硬化模型，将亲合力最高的适配子Cy5进行荧光标记，激光共聚焦显微镜下观察其与动脉粥样硬化病变组织的结合能力。 结果 12个巨噬细胞源性泡沫细胞的适配子均具有较好的亲和力，解离平衡常数（Kd值）范围在4.33～39.58 nmol/L之间，其中9号适配子（Apt9）的亲和力最高，Kd值为（4.33±0.33）nmol/L，体内亲和力检测发现Apt9能特异性结合ApoE-/-动脉粥样硬化血管斑块病变组织。 结论 筛选的Apt9适配子能与巨噬细胞源性泡沫细胞和动脉粥样硬化病变血管组织特异性结合，可以用于进一步的体内研究。

[关键词] 巨噬细胞源性泡沫细胞；适配子；亲和力；动脉粥样硬化

[中图分类号] R543.5 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2015）09（b）-0012-05

心脑血管疾病是危害人类健康的主要疾病，动脉粥样硬化是心脑血管疾病的主要病理基础，寻求有效的动脉粥样硬化靶向物，应用于动脉粥样硬化早期诊断与治疗是当前研究动脉粥样硬化的热点问题。巨噬细胞源性泡沫细胞形成是动脉粥样硬化主要的细胞学改变，在动脉粥样硬化病变斑块的早期即大量出现，它的形成是动脉粥样硬化病变形成和发展的核心步骤，泡沫细胞可以成为动脉粥样硬化病变诊断和治疗的靶点[1]。

指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）[2]是现有常用的靶向物筛选技术，通过SELEX技术可从人工合成的大容量单链随机寡核苷酸文库中筛选并富集获得靶物质特异性结合的寡核苷酸适配子，适配子可作为靶向引导物用于疾病的诊断与治疗[3]，本研究组前期利用巨噬细胞与泡沫细胞的细胞差异，利用SELEX技术筛选出了巨噬细胞源性泡沫细胞的12个适配子[4-5]，本研究拟采用酶联寡聚核苷酸吸附试验（enzyme-linked oligonucleotide assay，ELONA）对这些适配子进行Kd检测，并将筛选出的亲和力最高的适配子进一步通过体内实验验证动脉粥样硬化病变组织特异性，为动脉粥样硬化体内靶向引导物的研究提供实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞株 人单核细胞THP-1细胞株购自中国科学院上海细胞所。

1.1.2 实验动物 载脂蛋白E基因敲除（apolipoprotein E knockout，ApoE-/-）小鼠20只，雄性，6周龄，体质量（17±2）g，购于北京大学实验动物部，生产许可证号：SCXK（京）2006-0008。

1.1.3 主要试剂 细胞培养基、胎牛血清（Gibco公司）；油红O、鲑鱼精DNA（Sigma公司）；佛波酯（calbiochem公司）；辣根过氧化物酶标记Streptavidin、四甲基联苯胺（TMB）显色液（上海碧云天生物技术有限公司）；小鼠高脂饲料、普通饲料（广东省医学实验动物中心）。

1.1.4 主要仪器 多功能酶标仪（美国Biotek公司）；激光共聚焦显微镜（日本尼康公司）。

1.2 方法

1.2.1 适配子的合成 生物素与Cy5荧光素标记的适配子由上海生物工程技术服务有限公司合成。

1.2.2 泡沫细胞模型的建立 THP-1细胞培养于96孔培养板（美国Constar公司）中，置于37℃、5% CO2的培养箱中培养。实验前用100 nmol/L丙二醇甲醚醋酸酯（PMA）诱导72 h，使其分化成巨噬细胞，再用80 mg/L氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）孵育72 h，诱导分化成泡沫细胞。

1.2.3 动脉粥样硬化动物模型的建立 ApoE-/-小鼠，普通饲料饲养2周适应环境后，随机分成2组，每组10只。正常组给予普通饲料饲养，动脉粥样硬化模型组在普通饲料的基础上添加1.5%胆固醇和15%猪油高脂饲养。12周后麻醉处死动物，将主动脉段（自升主动脉至髂总动脉分叉）取出，中性甲醛固定，常规脱水，石蜡包埋，用Leitz1560切片机连续切片，苏木精-伊红（HE）染色，经病理鉴定，动脉粥样硬化造模成功。

1.2.4 适配子亲和筛选 1×106 THP-1细胞培养于96孔板中，THP-1细胞用100 nmol/L的PMA诱导72 h，使其分化成巨噬细胞，再用80 mg/L ox-LDL共孵育72 h，诱导成泡沫细胞，4%的多聚甲醛固定30 min。用1×磷酸盐缓冲液（PBS）洗板5次，5%牛血清白蛋白（BSA）于37℃封闭2 h，1×PBST（0.01% Tween-20）洗板5次。用PBS（含0.01%鲑鱼精DNA）将生物素标记的适配子与文库进行稀释，样品终浓度分别为1000、400、160、64、25、10、4 nmol/L，每组3个复孔。样品在95℃处理5 min后立刻置于冰上10 min，加入泡沫细胞的培养孔中37℃孵育1 h，1×PBST洗板5次，拍板。每孔加入50 μL辣根过氧化物酶标记的链亲和素-PBS溶液（稀释比1∶3000），37℃孵育30 min后洗涤5次，拍板。每孔加入50 μL TMB显色液，37℃避光显色10 min后每孔加50 μL 2 mol/L硫酸终止反应，酶标仪测定450 nm下的吸光度。

1.2.5 9号适配子与动脉粥样硬化病变小鼠的体内荧光成像 模型组与正常组分别经尾部静脉注射0.5 mL（10 μg DNA/10 mg体重）9号适配子（Apt9），30 min后，避光取出主动脉进行常规冰冻切片，激光共聚焦显微镜下观察并摄像。