丁香叶提取物对猪源性大肠杆菌的抑菌作用研究

■王 洁 王冬梅 齐富刚 刘明生 陈 明

（江苏农牧科技职业学院，江苏泰州 225300）

丁香种植广泛，取材方便，其叶中不同的化学成分有抗菌、抗病毒、抗炎镇痛、保肝利胆及增强机体免疫力等多种作用。炎立消胶囊、片剂的研制开发及临床疗效良好。黄酮是存在于植物体内一大类物质，能够有效清除体内的自由基及毒素，预防、减少疾病的发生，还具有消炎、抗过敏、广谱抗菌、抗病毒作用[1-2]。本研究以干燥丁香叶为材料，利用乙醇作为提取剂，采用超声辅助方法提取黄酮，探讨了丁香叶黄酮对两种不同血清型的大肠杆菌的抑制效果，为丁香叶提取物防治仔猪腹泻提供依据。

1 材料与方法

1.1 丁香叶

采集自泰州市园博园，将丁香叶先用自来水洗净，再用蒸馏水洗2遍，用滤纸或纱布吸干水，于90℃杀酶15 min，在60～65℃烘干至脆，粉碎，过筛，备用。

1.2 供试菌株

猪源性大肠杆菌K1、K2，由扬州动物医学学院微生物教研室赠予。

1.3 仪器设备

电子天平（万分之一）（梅特勒-托利多国际股份有限公司）；TD5M大容量低速离心机（常州中捷实验仪器制造有限公司）；KQ3200E超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；UV-1800紫外分光光度仪（上海奥析科学仪器有限公司）；旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；DHP-9272电热恒温培养箱（上海捷呈实验仪器有限公司）；Fw135中药粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公司）；YXQLS-50SH立式压力蒸汽灭菌器（上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；101-3电热恒温鼓风干燥箱（上海乔枫实业有限公司）；120622-07896孔板（BIOFIL）。

1.4 菌种的活化及传代培养

配制200 ml的普通肉汤液体培养基，高压灭菌后，冷却至室温，4℃保存备用。取在-20℃下甘油保存的大肠杆菌菌种K1和K2，分别蘸取菌液接种至两个加入5 ml肉汤液体培养基的玻璃试管中，空白对照管只加入5 ml肉汤液体培养基，标记接种的菌种和日期后，放入37℃恒温培养箱中培养12 h。

以相同接种方法对大肠杆菌菌种K1和K2进行传代纯化培养几代后，即可备用。

1.5 丁香叶总黄酮提取液前处理

先用旋转蒸发仪在60℃下，减压浓缩，将丁香叶提取液蒸发到少于15 ml，再放入减压烘干箱中烘干，备用；精确称取0.2 g丁香叶提取物，充分溶于1 ml去离子水中，配制成浓度为0.2 g/ml的丁香叶提取备用液，依次使用0.45 μm微孔滤膜、0.22 μm微孔滤膜对备用液进行过滤渣滓和除菌，置于4℃冰箱中进行短期保存；配制浓度为0.8 g/ml的丁香叶提取备用液，配制和储存方法同上。无菌条件下，用无菌水将药液稀释成8 000 μg/ml，备用。

1.6 抑菌圈直径的测定

在无菌操作下，取传代培养的大肠杆菌菌液用麦氏比浊法将菌液浓度确定为1.0×108CFU/ml；取2 ml菌液，加入普通固体培养基培养皿中，用三角玻璃棒刮匀，采用平板打孔法制作药敏试验培养基。

用无菌移液器分别吸取0.2 g/ml和0.8 g/ml的丁香叶提取液20 μl，加到培养皿的不同孔中，对照孔中加20 μl的0.9%无菌氯化钠溶液；然后，将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养16～18 h，观察结果，用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录数据。

判定药物对细菌抑制作用的标准：抑菌圈直径高于15 mm，细菌对药物高度敏感；抑菌圈在10～15 mm，细菌对药物中度敏感；抑菌圈小于10 mm，细菌对药物低度敏感；无抑菌圈，细菌对药物不敏感。

1.7 最低抑菌浓度的测定

将传代复壮的大肠杆菌用0.9%生理盐水稀释，用麦氏比浊法将菌液浓度确定为1.0×108CFU/ml，再将菌液稀释1 000倍，最终菌液浓度为1.0×105CFU/ml，备用。

在无菌条件下，取96孔板，第一行的第1～10孔中，每孔均加入200 μl大肠杆菌K1稀释液；在第1孔中加入200 μl浓度为8 000 μg/ml丁香叶总黄酮提取液，采用微量倍比稀释法，依次稀释直至第10孔，第11孔加0.9%无菌氯化钠溶液作为对照孔，1～11孔分别相当于总黄酮浓度为4 000、2 000、1 000、500、250、125、64.5、32.25、16.125、8.06 μg/ml。

为了通过肉眼明确判断试验结果，第二行和第四行的第1～6孔均加入200 μl大肠杆菌K1稀释液。

第五行和第七行从第1孔至第10孔中每孔均加入200 μl大肠杆菌K2稀释液，操作方法同大肠杆菌K1。第六行和第八行第1～6孔均加入200 μl大肠杆菌K2稀释液。将96孔板盖好，用封口膜封好，放入37℃恒温培养箱中培养24 h后，测定结果。

2 结果

2.1 抑菌圈直径结果

试验结果如表1。

表1 抑菌圈结果

2.2 丁香叶中总黄酮对猪源性大肠杆菌的最低抑菌浓度结果

丁香叶中总黄酮对猪源性大肠杆菌的最低抑菌浓度的试验结果见表2。由表2可判断，0.8 g/ml的丁香叶总黄酮提取备用液对猪源性大肠杆菌K1和K2的最低抑菌浓度为1 000 μg/ml。

表2 96孔板加药浓度及MIC结果

3 讨论

3.1 平板打孔法抑菌试验结果的分析

李熊利[3]通过滤纸片法研究霍山蹦蝗黄酮对大肠杆菌的抑菌作用，其抑菌圈直径为(18.08±0.75)mm，说明黄酮提取物对大肠杆菌有较强的抑菌作用。林志钦[4]用杯碟法研究了莲子心总黄酮提取液对大肠杆菌的抑菌活性，所得抑菌圈直径为(18.4±0.5)mm。常丽新等[5]通过使用浓度为942.21 μg/ml的丁香叶黄酮提取液用量分别为2、3 ml和4 ml，对大肠杆菌均有明显的抑制作用。本试验所得结果说明，丁香叶提取液浓度为0.2 g/ml时对猪体内采集的大肠杆菌K1的抑菌圈直径为10 mm，对猪体内采集的大肠杆菌K2的抑菌圈直径为13 mm，为中度敏感；浓度为0.8 g/ml的丁香叶提取液对猪体内采集的大肠杆菌K1的抑菌圈直径为20 mm，对猪体内采集的大肠杆菌K2的抑菌圈直径为21 mm，为高度敏感。因此，从猪体内采集的大肠杆菌对丁香叶提取物高度敏感，而且随着提取物浓度的增加，抑菌效果更佳。

3.2 最低抑菌浓度结果的分析

试验结果表明，丁香叶提取物对从猪体内采集的大肠杆菌K1和K2的最低抑菌浓度为1 000 μg/ml。常丽新等[5]通过微波提取法对丁香叶总黄酮进行提取后，对大肠杆菌的MIC值为942.21 μg/ml，说明丁香叶总黄酮对传统的大肠杆菌有一定的抑制作用，与本试验的结果基本吻合。

因此，猪体内采集的大肠杆菌对丁香叶提取物较敏感，丁香叶提取物浓度为0.8 g/ml时对大肠杆菌有明显的抑制效果，最低抑菌浓度为1 000 μg/ml。