胃癌细胞株MGC803中LTF基因的表达及其启动子甲基化相关性研究

陈旭艳 诸葛小菊 陈仁聘 黄智铭

胃癌细胞株MGC803中LTF基因的表达及其启动子甲基化相关性研究

陈旭艳 诸葛小菊 陈仁聘 黄智铭

目的钼检测胃癌细胞株MGC803内乳铁蛋白（LTF）基因的甲基化和表达情况，探讨LTF的DNA启动子区甲基化异常与其在胃癌内表达的相关性。方法钼用亚硫酸氢盐测序PCR方法检测MGC803启动子区甲基化状态，使用real-time PCR和Western b lot分别检测LTF在MGC803内的mRNA和蛋白表达水平。同时使用去甲基化剂5-aza-CdR处理胃癌细胞株，观察给药前后的DNA甲基化状态和mRNA表达情况。结果 MGC803启动子甲基化率达59.8%，使用5-aza-CdR处理的两组（2μmol/L组和10μmol/L组）和空白对照组甲基化率差异、LTF的mRNA表达差异均有统计学意义（均P＜0.05），并且随着MGC803启动子甲基化程度的下降，其mRNA和蛋白表达增加；而不同浓度药物处理组间差异均无统计学意义（均P＞0.05）。结论 LTF基因在胃癌细胞株MGC803内表现为较高甲基化状态，而且LTF的表达和其启动子区甲基化情况相关，使用去甲基化剂能逆转DNA的甲基化情况从而使其m RNA重新表达。

LTF基因 胃肿瘤 5-杂氮脱氧胞苷 DNA甲基化 CpG岛

胃癌发病过程受到多基因、多因素的影响。抑癌基因的表观遗传学改变是在胃癌癌变演变过程早期非常关键的因素之一。表观遗传学变化主要包含DNA异常甲基化，杂合性丢失（loss of Heterozygosity，LOH）以及组蛋白修饰等三大方面[1]。Lund等[2]证实DNA甲基化是肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG）失活机制中除基因缺失和基因突变这两大重要因素外的第三重要机制，有时候甚至越过前两者成为TSG沉默的唯一机制。

分子遗传学研究发现，在多种肿瘤内中染色体3p21区存在高频基因缺失[3]，有学者通过基因组杂交技术发现胃癌里3p21-23的缺失率为22%[4]。乳铁蛋白（lactotransferrin，LTF）基因，作为转铁蛋白家族的一员，亦位于人类染色体3p21.3区域，其在鼻咽癌、肺癌、前列腺癌等多种肿瘤及相应的肿瘤细胞株呈现表达降低或缺失的状态，有研究显示这与该基因启动子区域的异常甲基化高度相关[5-8]。5-Aza-2′-deoxycytidine（5-aza-CdR），能结合DNA甲基转移酶I并使其失活，逆转抑癌基因的高甲基化状态，重新激活基因表达。而目前对于LTF基因在胃癌内的研究尚少，因此本实验选择胃癌细胞株MGC803，观察LTF基因的表达和其启动子甲基化状态，旨在研究胃癌细胞株内LTF基因表达水平和启动子异常甲基化相关性，为胃癌临床诊断治疗提供一个新的可能靶点。

1 材料和方法

1.1 材料 人胃腺癌细胞株MGC803（中国上海科学院细胞库），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司），PRMI1640、PBS、青/链霉素（100U/ml）购于美国Gibco公司；5-aza-CdR（美国Sigma公司），用培养基充分溶解配成适量浓度的母液，分装后存于-80℃备用；TRIzol（美国Invitrogen公司）；逆转录试剂盒，real-time PCR试剂盒（SYBRRGreen Realtime PCRMasterMix，日本TOYOBO公司）；亚硫酸氢钠修饰试剂盒（美国ZYMO公司），Ex Taq HSDNA聚合酶、pMD 19-T Vecto（r日本TaKaRa公司）。抗体anti-Lactoferrin（美国Abcam公司，77 kDa，1∶1 000#ab10110），β-actin antibody（中国碧云天公司，42kDa，1∶1 000）。荧光定量PCR仪（型号CFX96，美国BIO-RAD公司）。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养和5-aza-CdR药物处理 SGC7901细胞用含10%胎牛血清的PRMI-1640培养液放置在37℃、5%C O2的细胞培养箱内培养。以1×105均匀铺入6孔板内，生长过夜。饥饿处理16 h，然后给予0μmol/L（空白对照组）、2μmol/L、10μmol/L的5-aza-CdR药物处理（分别为2μmol/L组和10μmol/L组），24h换液1次，培养5d后处理细胞。

1.2.2 real-time PCR检测药物干预前后LTF基因mRNA表达 取对照和药物处理组后回收细胞，用TRIzol提取细胞总RNA。约取1μg总RNA根据逆转录试剂盒说明书反应得到20μl体系的cDNA。以得到cDNA为模板，进行real-time PCR反应。引物由上海生工公司设计并合成，用GAPDH作为内参，引物序列分别为上游5′-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3′，下游5′-AGAGGCAGGGATGATGTTCTG-3′，扩增产物长度113 bp。LTF引物序列分别为：上游5′-TACAAATCCCAACAAAGCAGTG-3′，下游5′-CTTCCACAGGTCTATCCACACA-3′，产物大小约58bp。20μl PCR体系包括：SYBRRGreen Realtime PCR Master Mix 10μl，Plus solution 2μl，PCR Forward Prime（r10μmol/L）1.2μl，PCR Reverse Primer（10μmol/L）1.2μl，模板 cDNA 2μl，ddH2O 3.6μl。反应条件是95℃预变性30s，95℃5s、62℃10s、72℃15s进行40个循环。扩增结束进行溶解曲线分析来辨别是否有非特异性扩增。实验重复3次。数据用2－ΔΔCt法分析。

1.2.3 Western blot检测药物干预前后LTF基因蛋白表达 回收空白对照组和药物处理组细胞，加入适量的蛋白抽提 cell lysis buffer（每孔50μg）裂解细胞，然后用BCA法测定蛋白质的浓度。用12%SDS-聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，将蛋白用半干式电转移法转至硝酸纤维膜上，用5%脱脂牛奶TBST封闭硝酸纤维膜，室温下摇2 h。与一抗anti-Lactoferrin（77 kDa）结合（以TBS稀释，浓度依抗体而定)，4℃摇过夜，TBST洗4次，每次5min，用β-actin antibody（42kDa）作为内参。加入二抗(以TBS稀释，浓度依抗体而定)，室温摇1 h，TBST洗4次，每次5min。用碧云天公司的ECL试剂盒进行化学发光检测。X线片压片、显影、定影。

1.2.4 亚硫酸氢盐修饰DNA和BSP反应 取对照和药物处理组后回收细胞，按DNA提取试剂盒提取胃癌细胞株的基因组DNA。然后按甲基化修饰试剂盒进行亚硫酸氢钠修饰，使未甲基化的胞嘧啶（C）转化成胸腺嘧啶（T），而甲基化的Cm不变。以修饰后基因组DNA为模板，用Ex Taq HSDNA聚合酶进行LTF基因启动子扩增。LTF特异性引物参考文献[5]，分别是上游5′-TTGAGATTAGAGTTGGGATAGGG-3′，下游：5′-CCCCCAAACACCTACACTCA-3′，产物长度为397bp。其反应体系为50μl，包括：TaKaRa Taq HS 0.25μl，10×PCR Buffer 5μl，dNTPMixture 4μl，上游引物（10μmol/L）1μl，下游引物（10μmol/L）1μl，模板DNA 1μl（≤50ng），ddH2O 37.75μl。反应条件为95℃变性15min，94℃ 30s、56℃30s、72℃30s进行35次循环，然后72℃延伸7min。将获得的PCR产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳，凝胶图像分析系统记录数据。

1.2.5 挑选阳性克隆和测序 于紫外灯下切取含目的DNA的条带，按DNA凝胶回收试剂盒说明书对PCR产物进行回收纯化。取回收纯化的DNA 4.5μl，与pMD 19-T Vector 0.5μl，solution I 5μl配成10μl体系，轻轻混匀后16℃连T载体12h。取2.5μl连接产物与25μl的大肠杆菌感受态冰浴30min，42℃水浴90s，冰上放置3min，加入不含氨苄青霉素的LB培养基600μl，37℃，250r/min振摇45min，离心将菌液浓缩为15μl，并涂于氨苄（100μg/ml）抗性的LB平板上，先正面向上放置平板1h风干，翻转倒置平板37℃培养过夜，12～16h后即可长出菌落。随机挑选15个单克隆菌落，放在500μlLB液体培养基（含有氨苄青霉素100μg/ml），摇浑浊菌液。用普通PCR鉴定阳性重组子，取1μl摇浑的菌液做PCR模板，2×Taq酶MIX 5μl，上下游通用引物各0.2μl，ddH2O 3.6μl构成10μl PCR体系进行扩增反应。用1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定结果。最后送检10个克隆于上海生工公司测序。

1.3 统计学处理 采用 SPSS13.0统计软件，realtime PCR结果和总体甲基化率组间比较采用Oneway ANOVA分析，组间两两比较采用LSD-t法。CpG位点甲基化率比较采用行×列表χ2检验。

2 结果

2.1 胃癌细胞株MGC803 LTF基因的mRNA表达和启动子甲基化率 见图1。

图1 3组LTFmRNA表达（A）和启动区甲基化率（B）的比较（与空白对照组比较，*P＜0.05）

由图1可见，不同浓度5-aza-CdR处理胃癌细胞株MGC803后，2μmol/L组和10μmol/L组其mRNA表达较空白对照组明显增加，差异均有统计学意义（均P＜0.05），但2μmol/L组和10μmol/L组间比较差异无统计学意义。甲基化率空白对照组为59.82%，2μmol/L组为29.46%，10μmol/L组为15.17%（P＜0.05），但2μmol/L组和10μmol/L组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。

2.2 胃癌细胞株MGC803 LTF基因蛋白表达 见图2。

图2 5-aza-CdR药物处理前后LTF的蛋白表达（1、2、3分别代表空白对照组、2μmol/L组、10μmol/L组）

由图2可见，药物处理前后LTF基因蛋白表达空白对照组较低，两个不同浓度药物组均较空白对照组明显增加。

2.3 胃癌细胞株MGC803药物处理前后LTF基因甲基化情况 见图3～5。

图3 LTF基因的BSP法电泳图结果

由图3可见，目的条带397bp清晰。

由图4可见，所选阳性单克隆概率达83.3%（5/6）。

由图5可见，其中3，4，5，6，11，12，13号CpG位点甲基化程度超过50%，呈高甲基化状态。而用5-aza-CdR处理后，与空白对照组相比，发现14号位点甲基化情况变化不大。3、4、5、6、10、11、12、13号这8个CpG位点甲基化率较空白对照组明显降低，均有统计学意义（均P＜0.05）。

3 讨论

LTF基因位于染色体短臂3p21.3的CER1区，编码包含17个外显子长约2.4kb的mRNA，翻译一个分子质量约为80kD的铁结合蛋白，命名为乳铁蛋白（lactoferrin，LF）[9]。该基因在多种恶性肿瘤内表现为候选的抑癌基因。

LTF基因在鼻咽癌，肺癌，前列腺癌等多种肿瘤及相应的肿瘤细胞株呈表达降低或缺失的状态，有研究显示这种现象与该基因启动子区域的甲基化异常高度相关[5-8]。为研究LTF基因启动子甲基化对LTF在胃癌里表达的影响，我们使用BSP方法来检测胃癌细胞株的甲基化情况。BSP法是公认的分析DNA甲基化的金标准[10-11]。本研究结果显示LTF基因在胃癌细胞株MGC803内是呈高甲基化的（总体甲基化率是59.82%），这与学者在鼻咽癌和肺癌里的报道一致[6-7]。去甲基化剂5-aza-CdR作用后随着药物处理组LTF基因启动子区总体甲基化程度下降，其mRNA重新表达。这些结果进一步证明LTF基因启动子区异常高甲基化是引起LTF基因在胃癌组织和细胞株里沉默的关键表观遗传学机制，同时这种“疾病状态”是可以被去甲基化剂逆转的。但是两个药物处理组间的甲基化率和mRNA表达差异无统计学意义，这可能和5-aza-CdR对BGC823的去甲基化作用达到平台期相关。该段DNA启动子区含有14个CpG岛，CpG岛是一段长约1kb的富含饰CpG和GpC序列的DNA结构。进一步分析发现其中3，4，5，6，11，12，13号CpG位点甲基化程度超过50%，呈高甲基化状态。而用5-aza-CdR处理后，与空白对照组相比，发现14号位点甲基化情况变化不大。3，4，5，6，10，11，12，13号这8个CpG位点甲基化率较空白对照组明显降低，且有统计学意义（P＜0.05）。我的猜测这些位点和LTF在胃癌的表达缺失及逆转其表达可能相关。

图4 LTF甲基化后目的DNA连T载体挑选阳性克隆电泳图（1，2，3，4，6为阳性克隆，成功连接T载体，509 bp；5为阴性克隆，未连接T载体，397 bp）

图5 3组LTF基因启动子区14个CpG岛的甲基化率改变（与空白对照组比较，*P＜0.05）

大量研究证明LTF在体内外实验中有抗肿瘤作用[12-14]，但是其机制目前并不明确。大量文献报道在乳腺癌，头颈部肿瘤和其他肿瘤细胞内，LTF蛋白可以激活细胞周期相关蛋白，进而阻滞恶性肿瘤细胞从G1期到S期的过渡，最终抑制肿瘤细胞的增殖[15－16]。这提示LTF蛋白对这些肿瘤有化学预防作用。有些研究认为LTF的蛋白能调节细胞周期相关蛋白，如细胞周期蛋白cyclin、细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclin-dependent kinase，CDK）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂（cyclin dependent kinase inhibitor，CKI）和抑癌基因（p53和Rb）的表达，进而影响细胞周期的整个进程[17]。但是也有学者持不同意见，认为LTF蛋白补给治疗能调节MAPK（mitogen-activated protein kinase）通路却不会影响p53的表达[18]。Oh等[19]证实LTF蛋白参与激活NF-kB（nuclear factor-κB，NF-kB）信号通路，进而激活NF-kB的相关靶基因，同时激活的NF-kB能抑制p53的转录，p53能反向调节下游基因mdm2和p21的表达，最终遏制肿瘤细胞的生长。Xu等[20]报道LTF在SGC7901里能够抑制蛋白激酶的活化，调节其下游蛋白的磷酸化然后诱导肿瘤细胞凋亡。另有学者报道LTF在结肠癌里促进细胞凋亡的机制与激活Fas信号通路，增强caspase-8和caspase-3表达相关[21]。

在本研究中，我们发现LTF基因在胃癌里是低表达的，而且与LTF启动子甲基化高度相关。DNA甲基化作为表观遗传学重要机制之一，其本身优势在于不涉及基因序列的改变就可以调控基因的表达，并且能够被甲基化转移酶抑制剂逆转的。5-aza-CdR，作为一种甲基化转移酶，已成功应用于白血病的临床治疗[22]，这对其他机制和抑癌基因甲基化异常相关的肿瘤来说是个成功的鼓舞。LTF可作为胃癌内的候选抑癌基因，由于LTF在胃癌内表达和基因甲基化机制相关，为未来可能

通过甲基化转移酶抑制剂来进行肿瘤的预防和早期治疗提供理论依据。

[1]Choi IS,Wu T T.Ep igenetic alterations in gastric carcinogenesis [J].CellRes,2005,15(4):247-254.

[2]Lund A H,van Lohuizen M.Ep igenetics and cancer[J].Genes Dev,2004,18(19):2315-2335.

[3]Hesson L B,Cooper W N,Latif F.Evaluation of the 3p21.3 tumour-supp ressorgene c luster[J].Oncogene,2007,26(52):7283-7301.

[4]Sakakura C,MoriT,Sakabe T,etal.Gains,losses,and amp lifications ofgenom icmaterials in p rimary gastric cancers analyzed by comparative genom ic hyb rid ization[J].Genes Chrom osomes Cancer,1999,24(4):299-305.

[5]YiH M,LiH,Peng D,et al.Genetic and ep igenetic alterations o f LTFat3p21.3 in nasopharyngealcarcinoma[J].OncolRes,2006,16 (6):261-272.

[6]Zhang H,Feng X,Liu W,etal.Underlying m echanism s for LTF inactivation and its functionalanalysis innasopharyngea lcarcinom a celllines[J].JCellBiochem,2011,112(7):1832-1843.

[7]Iijim a H,Tom izawa Y,IwasakiY,etal.Genetic and ep igenetic inactivation of LTF gene at3p21.3 in lung cancers[J].Int JCancer, 2006,118(4):797-801.

[8]Shaheduzzaman S,Vishwanath A,Furusato B,et al.Silencing o f Lactotransferrin exp ression bym ethylation in p rostate cancerp rog ression[J].Cancer BiolTher,2007,6(7):1088-1095.

[9]No jim a Y,SuzukiY,IguchiK,etal.Development of poly(ethylene g lycol)con jugated lactoferrin for oraladm inistration[J].Bioconjug Chem,2008,19(11):2253-2259.

[10]Clark S J,Harrison J,PaulC L,eta l.High sensitivitym app ing of methylated cytosines[J].Nuc leic Acids Res,1994,22(15):2990-2997.

[11]Frommer M,McDonald L E,Millar D S,et al.A genom ic sequenc ing p rotocol that yields a positive d isp lay of 5-m ethylcytosine residues in ind ividualDNA strands[J].Proc NatlAcad Sci U SA,1992,89(5):1827-1831.

[12]Tsuda H,Kozu T,Iinuma G,et al.Cancer p revention by bovine lacto ferrin:from animal stud ies to hum an trial[J].Biometals, 2010,23(3):399-409.

[13]Yamada Y,Sato R,KobayashiS,etal.The antip roliferative effect o fbovine lactoferrin on caninem ammary g land tum or cells[J].J VetMed Sci,2008,70(5):443-448.

[14]Zhou Y,Zeng Z,Zhang W,etal.Lactotransferrin:a cand idate tum or supp ressor-Deficient exp ression in humannasopharyngeal carcinom a and inhibition of NPC cell p roliferation by modu lating the m itogen-activated p rotein kinase pathway[J].Int JCancer,2008,123(9):2065-2072.

[15]Wang J,LiQ,Ou Y,etal.Inhibition of tumor g row th by recom binant adenovirus containing human lactoferrinthrough inducing tumor cell apop tosis in m ice bearing EMT6 b reast cancer[J]. Arch Pharm Res,2011,34(6):987-995.

[16]Xiao Y,Monitto C L,Minhas K M,et al.Lacto ferrin down-regulates G1 cyc lin-dependentkinases during grow th arrestofhead and neck cancer cells[J].Clin Cancer Res,2004,10(24):8683-8686.

[17]Son H J,Lee SH,ChoiSY.Human lactoferrin controls the levelof retinob lastoma p rotein and its ac tivity[J].Biochem Cell Biol, 2006,84(3):345-350.

[18]Zhou Y,Zeng Z,ZhangW,etal.Lactotransferrin:a candidate tumor supp ressor-Deficientexp ression in humannasopharyngeal carcinoma and inhibition of NPC cell p roliferation by modulatingthem itogen-activated p rotein kinase pathway[J].Int JCancer,2008,123(9):2065-2072.

[19]Oh SM,Pyo CW,Kim Y,etal.Neutrophil lactoferrin up regulates the human p53 gene through induc tion ofNF-kappaB ac tivation cascade[J].Oncogene,2004,23(50):8282-8291.

[20]Xu XX,Jiang H R,LiH B,etal.Apop tosis ofstomach cancer cell SGC-7901 and regulation of Akt signaling wayinduced by bovine lac toferrin[J].JDairy Sci,2010,93(6):2344-2350.

[21]Fujita K,Matsuda E,Sekine K,et al.Lactoferrin enhances Fas exp ression and apop tosis in the co lon mucosa of azoxym ethane-treated rats[J].Carcinogenesis,2004,25(10):1961-1966.

[22]Kantarjian H,Oki Y,Garcia-Manero G,et a l.Results of a random ized study o f 3 schedules of low-dose decitabine inhigher-riskmyelodysp lastic synd rome and chronic myelom onocytic leukem ia[J].Blood,2007,109(1):52-57.

Expression of LTF gene and its promotor region methylation in human gastric cancer cell lines MGC803

CHEN Xuyan，ZHUGE Xiao-ju,CHEN Renpin,et al.Department of Gastroenterology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou 325000,China

Objective To investigate the exp ression of LTF(lactotransferrin)gene and its p romoter region in human gastric cancer cell line MGC803.Methods The exp ression of LTFm RNA and p rotein levels in MGC803 cells were detected by real-time PCR and Western b lot,respec tively;LTF p romotormethylation status was determ ined by Bisulfite genom ic sequencing PCR(BSP).MGC803 cells were treated w ith 5-aza-CdR to reversemethylation status,Results LTF p romotormethylation rate in MGC803 was 59.8%.Compared to control g roup,methylation status and m RNA exp ression of LTF in 5-aza-CdR treatment groups(2μmol/L and 10μmol/L)were reversed(P＜0.05);however there was no d ifference between d ifferent treatmentg roups(P＞0.05).Conclusion The LTFmethylation in p romoter region is high and LTFm RNA exp ression in MGC803 cells is low,5-aza-CdR can reverse themethylation status and up-regulate LTFm RNA exp ression.

Stomach neop lasms Lac totransferrin 5-aza-CdR DNAmethylation CpG island

2015-03-06）

（本文编辑：沈昱平）

温州市科技局项目（Y20140275）

325000温州医科大学附属第一医院消化内科（陈旭艳、陈仁聘、黄智铭）；温州医科大学附属第三医院消化内科（诸葛小菊）

黄智铭，E-mail：w yyyhzhim ing@126.com