高效液相色谱法同时检测秸秆饲料中异丙草胺和异丙甲草胺的含量

■李军德 赵艳芳 宋吉英

（1.青岛农业大学校医院，山东青岛266109；2.青岛农业大学化学与药学院，山东青岛266109）

异丙草胺是一种氯代乙酰胺类化合物，它是一种新型的芽前除草剂，能与防治阔叶杂草的除草剂混用，同时也可扩大防治杂草、降低用药量，可代替乙草胺使用。异丙甲草胺和异丙草胺是同分异构体，是细胞分裂抑制剂，可通过幼芽吸收，向上传导，抑制蛋白质合成干扰卵磷脂形成，从而抑制幼芽及其根的生长，常用于防除水稻、玉米、大豆、花生等地的牛筋草、马唐、狗尾草、棉草、苋菜、马齿苋等。玉米、花生等农作物的秸秆可直接或发酵后作为饲料原料用于牛、马、骡、羊等畜禽的喂养。通常对于许多农药来说，在环境中的降解是消除其污染的重要途径之一，是确定其在环境中归宿的一个重要依据。除草剂在农作物秸秆中的残留，会影响其作为饲料原料的质量。目前国际上对于异丙草胺和异丙甲草胺常用的检测方法主要为气相色谱法和液相色谱法。本文的创新点是用高效液相色谱法同时检测农作物秸秆中异丙草胺和异丙甲草胺的含量，对农作物秸秆作为饲料原料起到一定的参考作用。

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

试剂：异丙草胺和异丙甲草胺标准品（Sigma）；甲醇、乙腈（色谱纯）。

仪器：Agilent-1100型高效液相色谱仪；Eclipse Plus C-18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色谱柱（安捷伦科技公司）；TU-1901型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；KQ-700DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；LXJ-802医用低速离心机（金坛市恒丰仪器厂）；Cascada超纯水系统（Pall Corporation）；RE-52AA型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；98-1磁力搅拌器（上海司乐仪器有限公司）；玻璃仪器超声清洗1 h，用超纯水洗净后烘干备用。

1.2 色谱条件

流动相：乙腈-水=70∶30(体积比);流速0.8 ml/min;柱温：25 ℃；检测波长：220 nm；进样量：20 μl。

1.3 标准溶液配制

用乙腈做溶剂，分别配制一定浓度的异丙草胺和异丙甲草胺的标准品储备液，做标准工作曲线时可将储备液逐级稀释使用。

1.4 样品的前处理方法

将玉米、花生等农作物秸秆晾干，切段，粉碎，用分析天平称取2.0 g于250 ml磨口锥形瓶中，加入100 ml乙腈，封口后磁力搅拌提取30 min，将混合物转移到离心管中，以4 000 r/min的转速离心，上清液在圆底烧瓶中旋转蒸发至干，加入2 ml流动相溶解，用一次性有机滤头过滤，得样品溶液，在1.2节的色谱条件下待测。

2 结果与讨论

2.1 检测波长的确定

实验中将异丙草胺和异丙甲草胺的标准溶液稀释至适量浓度后，在紫外分光光度计上进行紫外扫描，所得谱图如图1和图2所示。由谱图可知，异丙草胺和异丙甲草胺的最大吸收波长均为220 nm，故选择220 nm为最佳检测波长。

图1 异丙草胺的紫外光谱

图2 异丙甲草胺的紫外光谱

2.2 流动相种类的选择

高效液相色谱中流动相的种类及配比对样品峰及混合物的分离有着决定性的作用，两个目标峰之间的距离须足够大及峰须足够窄才能达到分离效果，当仪器与色谱柱确定时，流动相的种类及配比是影响两种组分分离的决定性因素。实验中分别配制了甲醇-水和乙腈-水的流动相，对异丙草胺标准溶液进行高效液相测定，得到谱图3。

图3 异丙草胺在不同流动相下的色谱

从图3可以看出，用甲醇-水做流动相时，得到的色谱峰过宽，峰的对称性差；而用乙腈-水做流动相时峰形较好，因此，实验中选择乙腈-水做流动相。

2.3 流动相配比的选择

选择流速分别为0.6、0.8、1.0 ml/min，在乙腈-水不同流动相配比下测得异丙草胺和异丙甲草胺的色谱图，根据色谱图的相关信息，确定最佳流动相配比。

由图4和表1可知，随着流动相中乙腈含量的减少，保留时间延长，在乙腈-水=60∶40时，保留时间最长，峰宽最宽；在乙腈-水=70∶30时色谱峰形较好，峰宽较窄，异丙甲草胺和异丙草胺色谱峰的对称因子分别为0.953和1.429，峰形较为理想，因此0.6 ml/min流速条件下选择乙腈-水=70∶30作为流动相。

图4 流速为0.6 ml/min时异丙草胺和异丙甲草胺的不同流动相配比色谱

表1 流速为0.6 ml/min时不同流动相比例的色谱峰分析结果及系统评价

图5 流速为0.8 ml/min时异丙草胺和异丙甲草胺的不同流动相配比色谱

表2 流速为0.8 ml/min时不同流动相比例的色谱峰分析结果及系统评价

由图5和表2可知，随着流动相中乙腈含量的减少，保留时间增大，在乙腈-水=60∶40时，保留时间长，峰宽较大；在乙腈-水=70∶30时得到的峰形较高，峰宽较小，峰的对称性比较好，因此0.8 ml/min流速条件下选择乙腈-水=70∶30作为流动相。

图6 流速为1.0 ml/min时异丙草胺和异丙甲草胺的不同流动相配比色谱

表3 流速为1.0 ml/min时不同流动相比例的色谱峰分析结果及系统评价

由图6和表3可知随着流动相中乙腈含量的减少，保留时间增大，在乙腈-水=60∶40时，保留时间长，峰宽较大；在乙腈-水=70∶30时得到的峰形较高，峰宽较小，峰的对称性比较好，因此1.0 ml/min流速条件下选择乙腈-水=70∶30作为流动相。

综合以上的分析结果，在不同的流速下，乙腈-水=70∶30时的分离效果最好，实验中确定最佳流动相配比乙腈-水=70∶30。

2.4 流速的选择

在高效液相色谱检测中，流速对色谱峰的峰形，保留时间，对称因子等因素有着决定性的作用。本实验在确定最佳流动相配比乙腈-水=70∶30的前提下，对异丙草胺和异丙甲草胺混合标准溶液在不同流速下的色谱图分析，以确定最佳流速，所得结果见图7和表4。

由图7和表4可知，随着流速的增大，保留时间缩短，在流速为1.0 ml/min时，保留时间短，但是流速过快，柱压较大，且色谱峰峰面积小；在流速为0.6 ml/min时，保留时间过长，峰太宽，对称因子不好；在流速为0.8 ml/min时，保留时间适中，峰面积大，峰形较理想，因此实验流速确定为0.8 ml/min。

图7 异丙草胺和异丙甲草胺在最佳流动相配比下的不同流速色谱

表4 异丙草胺和异丙甲草胺在最佳流动相配比下不同流速的色谱峰分析结果及系统评价

2.5 异丙草胺和异丙甲草胺保留时间的确定

本实验需要同时检测异丙草胺和异丙甲草胺两种目标物，因此首先需确定出这两种目标物的保留时间以进行定性分析。分别对异丙草胺和异丙甲草胺的标准溶液在1.2节的色谱条件下进样分析，以确定其保留时间；再在相同的色谱条件下分析异丙草胺和异丙甲草胺的混合标准溶液，根据二者的保留时间确定混合标准溶液中的组分。所得结果见图8，图9和图10。

图8 异丙甲草胺标准溶液色谱

图9 异丙草胺标准溶液色谱

图10 异丙草胺和异丙甲草胺混合标准溶液色谱

由结果可知，在1.2节色谱条件下，异丙甲草胺和异丙草胺的保留时间分别为8.301 min和10.383 min，二者的混合物可以得到很好的分离，且异丙甲草胺先于异丙草胺出峰。

表5 方法的性能数据

3 结论

本文的创新点是用高效液相色谱法同时检测农作物秸秆中异丙草胺和异丙甲草胺的含量，实验中对该方法的色谱条件进行了探索，实验采用Agilent-1100高效液相色谱仪，Eclipse Plus C-18(5 μm，4.6 mm×250 mm)色谱柱，以乙腈-水=70∶30(体积比)为流动相，检测波长为220 nm，柱温为25℃，流速为0.8 ml/min的条件下确定了测定作物秸秆中异丙草胺和异丙甲草胺含量的方法。在该实验条件下异丙草胺和异丙甲草胺有较好的分离度，通过精密度实验和加标回收实验等证明该方法稳定可靠，可用于实际样品的分析检测。

（参考文献12篇，刊略，需者可函索）