多指标综合评分法优选甘草抗氧化活性成分闪式提取工艺

阚俊明，雷岱虹，宗 颖，查荣博，张 辉*，孙佳明*

(1.黑龙江中医药大学，哈尔滨150000;2.长春中医药大学，长春130117;3.吉林农业大学，长春130118)

甘草(Glycyrrhiza)为多年生草本植物，属豆科，主要有乌拉尔甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch.)、胀果甘草(Glycyrrhiza inflataBatal.)和光果甘草(Glycyrrhiza glabraL.)。甘草味甘甜，性平，归心、肺、脾、胃经，具有补脾益气，清热解毒，缓急止痛，祛痰止咳，调和诸药的功效［1］。研究［2-7］表明，甘草具有抗炎、抗菌、抗过敏、抗氧化、抗疲劳、抗焦虑和抗心律失常等生理功能。尤其甘草中黄酮类成分能够明显的清除或抑制体内自由基，并且对食用油脂也具有良好的抗氧化效果，所以甘草除药用外，也多应用于食品和化妆品行业。目前，甘草活性成分的提取方法有快速溶剂萃取法、超声波法、微波法、超临界CO2萃取法、高速逆流色谱法、超高压法、回流提取法等［8-13］。闪式提取法是在适当溶剂条件下，利用内外刀刃间形成的超速动态分子的渗透作用和强力振动作用，从而破坏植物细胞组织，使组织细胞内部的有效成分迅速达到组织内外平衡，进而达到快速提取目的的一种方法，具有高效节能、操作简便、节能经济等优点［14-15］。本实验采用正交试验设计，利用闪式提取法提取甘草抗氧化活性成分，以甘草总黄酮含量、DPPH自由基清除率和浸膏得率的综合评分为指标，考察甘草抗氧化活性成分闪式提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂 甘草药材购于吉林大药房，均经长春中医药大学张辉教授鉴定为甘草(Glycyrrhiza uralensis Fisch)的干燥根;芦丁对照品(中国药品生物制品检定所);DPPH自由基(美国Sigma公司);甲醇、无水乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备 闪式提取器(北京金鼐科技发展有限公司);BP211D型电子天平(德国赛多利斯股份公司);紫外可见分光光度计(Cary 50 UV-VIS)(美国瓦里安公司);KQ5200型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);酶标仪Bio-Rad;数显鼓风干燥箱(上海博迅实业有限公司);DZF-6050型真空干燥箱(上海一恒科技有限公司);电热恒温水浴锅(北京华恒万仪仪器有限公司);旋转式恒温振荡器(苏州培英实验设备有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 浸膏得率的测定 定量量取甘草提取液，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干后，置真空干燥箱内干燥24 h，将干燥后的提取物取出，精密称定质量。

1.3.2 甘草总黄酮含量测定 取芦丁对照品40 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加入甲醇5 mL，置水浴上微热使溶解加甲醇至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置50 mL量瓶中，加水至刻度，制得芦丁对照品溶液(0.40 mg/mL)。精密量取对照品溶液0、1、2、3、4、5 mL置于25 mL 容量瓶中，加水至5 mL，各加入5%NaNO2溶液1 mL混匀，放置等待6 min，再加入10%Al(NO3)3溶液1 mL，摇匀后放置等待6 min后，此时溶液颜色加深，最后加入浓度为4%NaOH溶液10 mL，加水至刻度，摇匀，放置等待15 min。以70%的乙醇为空白，用紫外分光光度法于510 nm波长处测定不同浓度芦丁对照品溶液的吸光度。以吸光度(Y)为纵坐标，芦丁对照品溶液的浓度(X)为横坐标，进行直线回归，制备标准曲线［16］，回归方程为A=10.010 2 C+0.012 6(r=0.999 9，n=5)，结果表明芦丁在0.008～0.040 mg/mL浓度范围内呈良好的线性关系。吸取相应的甘草闪式提取液适量，分别置于容量瓶中，按以上方法，于510 nm处测定吸光度，以不加供试品的平行样为空白。根据标准曲线计算出供试品中总黄酮的含量。

1.3.3 对DPPH自由基清除活性的测定 运用抑制DPPH的方法［17］，对甘草提取物进行体外抗氧化活性评价。精密量取浓度为26.4 mg/L的DPPH 70%乙醇溶液2 mL，分别加入至2 mL以70%乙醇为溶剂已配制好的不同浓度的样品液中，充分混匀，避光条件下反应30 min，在517 nm测定其吸光度。同时以2 mL 70%乙醇溶液作为空白对照A0，以样品溶液2 mL与2 mL7 0%乙醇溶液混合作为样品对照Aj，并以VitE作为阳性对照，以样品液对DPPH溶液清除率Y计算公式。

1.3.4 正交试验 以乙醇为提取溶媒，以提取时间、醇浓度、提取次数、固液比为考察因素，进行L9(34)正交试验，并以甘草总黄酮含量、DPPH自由基清除率和浸膏得率为评价指标，筛选最佳工艺条件，结果见表1。评分时以各指标的最大值为参照将数据进行归一化，再给出不同的权重。从生物活性和化学成分两个角度来分析，将DPPH自由基清除率的权重系数设为0.5，总黄酮含量的权重系数设为0.3，浸膏得率的权重系数设为0.2。以综合值进行统计分析，结果见表2和表3。其中综合评分Y=0.3X1×100/7.16+0.5X2×100/55.77+0.2X3×100/29.00。

表1 因素水平表

表2 工艺优化正交试验方案设计及结果

表3 方差分析表

2 结果与分析

直观分析表明，以综合评分为标准，在所选因素水平范围内，醇浓度对甘草抗氧化有效成分的提取效果影响最大。方差分析表明，因素B(醇浓度)为主要影响因素，具有显著性，因素A、C、D不显著。故选取最佳提取条件为A2B1C3D2，即90%乙醇，料液比为1∶20(g/mL)，提取次数3次，每次2 min。

为进一步考察优选工艺的可靠性及稳定性，取3分药材按上述最佳提取工艺进行验证实验，甘草生药量总黄酮含量为7.24%;DPPH自由基清除活性为60.26%;对浸膏得率为16.30%。验证实验结果表明，该优选工艺稳定、可靠。

3 小结

本文针对甘草中抗氧化有效成分的提取，重点考察了其DPPH自由基清除能力，并结合总黄酮含量、浸膏得率综合评分，从而得到富含抗氧化活性成分的甘草闪式提取工艺，更有效地控制生产过程，从根本上保证甘草在食品、药品方面的质量。

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