蒙药尼如哈优化剂对溃疡性结肠炎相关癌小鼠的一般情况和结肠组织病变的影响

2015-01-17布图雅孙勤暖广布加甫藏登乌日嘎

中成药 2015年4期

布图雅，孙勤暖，广布加甫·藏登，乌日嘎

（1.内蒙古医科大学，内蒙古呼和浩特010059；2.内蒙古医科大学第一附属医院病理科，内蒙古呼和浩特010059；3.新疆医科大学校医院，新疆乌鲁木齐830000）

布图雅1，孙勤暖2，广布加甫·藏登3，乌日嘎1

目的探讨尼如哈优化剂对溃疡性结肠炎相关癌的防治作用。方法98只Balb/c小鼠随机分空白组、模型组、优化剂高、中、低剂量治疗组，传统剂治疗组，柳氮磺吡啶治疗组7组，每组10只；正常组除外，各组以AOM/DSS复合法复制模型，从第9周开始模型组予等剂量生理盐水灌肠，治疗各组分别予相应的药液进行灌肠治疗，共11周。实验第20周末将全部小鼠处死取全结肠，肉眼及光镜下观察其结肠组织形态学改变及异常隐窝的变化。期间每周一次观察小鼠一般情况。结果模型组小鼠结肠肉眼改变以散在、多发性息肉状隆起性病变为主。病理改变以低级别上皮内瘤变和/或高级别上皮内瘤变为主；低、中剂量组肉眼改变均以单发或少数息肉状隆起性病变为主。镜下以增生性息肉改变为主；高剂量组、柳氮磺吡啶组肉眼改变均以结肠黏膜充血、水肿为主。镜下改变均以腺体增生为主，未见溃疡及明显的异常隐窝及上皮内瘤变。与模型组比较有极显著差异（P＜0.01）。空白组小鼠情况良好，摄食量、大便正常；模型组小鼠体质量逐渐减轻，倦怠拱背、有黏液血便，并出现脱肛；尼如哈治疗各组小鼠体质量和食量不同程度增加、血便次数明显减少。结论蒙医尼如哈优化剂可用于防治溃疡性结肠炎相关癌。

蒙医；尼如哈优化剂；结肠炎相关性结肠癌；上皮内瘤变

结肠癌是我国常见的恶性肿瘤之一。其中约1/4的患者其病因及发病机制与慢性炎症相关［1］。研究表明，在结肠癌出现之前，至少要经过数十年的癌前演变期［2］。而慢性溃疡性结肠炎伴上皮内瘤变是主要的结肠癌前病变。因此，探索结肠炎相关性结肠癌的有效防治措施，防止结肠炎向结肠癌演变是一个重要的课题［3］。

蒙医认为溃疡性结肠炎相关性结肠癌（CAC）属大肠“血痞病”范畴，是由大肠 “宝如病”迁延不愈导致的一类 “痞病”。尼如哈优化剂为笔者结合蒙医理论和现代药理学研究，整理、分析蒙医治疗大肠宝如病的尼如哈剂，进行优化而成。应用于轻、中度溃疡性结肠炎的治疗取得了良好的临床疗效［4］。基于此，本实验应用AOM/DSS复制小鼠溃结相关癌变模型，期望通过观察各组CAC小鼠一般情况及结肠组织形态学变化，探讨尼如哈优化剂对其一般情况的改善及结肠组织的保护作用，进而为临床防治CAC提供可参考的实验数据和安全有效的治疗方法。

1 材料

1.1 实验动物 Balb/c雄性小鼠，清洁级，98只。购自北京华阜康生物科技有限公司，许可证号：SCXK（京）2009-0004。

1.2 主要试剂及仪器氧化偶氮甲烷（AOM）（美国SIGMA公司，批号A5486-25MG）；葡聚糖硫酸钠（DSS分子质量50 000）（美国AMERESCO公司，批号0918-10）；甲醛、无水乙醇购自天津国药集团（货号 HX0174，HX0046）；苏木素细胞染色液、伊红染色液购自福州迈新生物技术开发有限公司；组织切片石蜡块购自上海华灵公司（GCHC0004）；YD-12G自动脱水机；YD-6D包埋机；RM2135 Leica切片机；HI1210Leica摊片机；烘片机。

1.3 实验药物尼如哈传统剂：载于《甘露四部》，由诃子、枇杷叶、茜草、秦艽花、藜芦、大黄组成。购自内蒙古医科大学附属中蒙医院。

尼如哈优化剂：由诃子、石榴、荜茇等为主的方剂。购自内蒙古医科大学附属中蒙医院。

尼如哈传统剂及优化剂的制备：称定质量、粉碎、梯度（100～250目孔）过筛。用蒸馏水煮沸后静置，取上清液备用。

柳氮磺吡啶肠溶片（国药准字 H31020840，批号22120608），上海福达制药有限公司生产。

2 方法

2.1 模型制备及分组处理参照文献［5］所有小鼠适应性饲养1周。按体质量随机分为空白组、模型组、优化剂高、中、低剂量治疗组、传统剂治疗组、柳氮磺吡啶治疗组7组，每组10只。小鼠腹腔注射1次1 g/L质量浓度的AOM（10 mg/kg），继而饮用添加3%DSS饮用水1周，再饮用正常饮用水两周为一个循环。正常组除外，其余各组重复上述循环3次。第9周开始模型组予等剂量生理盐水，治疗组按实验动物与人的剂量换算比率，分别予450 mg/mL、225mg/mL、112.5mg/mL优化剂、450mg/mL传统剂和30 m g/mL柳氮磺吡啶。每次灌肠药量为0.1 mL/10 g［6］，每日一次灌肠，共治疗11周。

2.2 标本采集全部小鼠于实验第20周末处死，取出全结肠，沿纵轴切开，用生理盐水迅速冲净后置于标本体积10倍以上的10%中性福尔马林溶液中固定，备测。

2.3 指标检测

2.3.1 结肠大体损伤的评分将小鼠结肠向上平展于白色硬板，用精密电子秤秤取其净质量，用游标卡尺测量其长度，随即大头针固定，用放大镜观察黏膜的损伤程度、炎症、溃疡以及肿瘤发生等变化并予以评分。评分标准见表1［7］。

表1 结肠大体损伤评分标准

2.3.2 异常隐窝用0.38% （体积分数）美蓝将结肠染色，解剖显微镜下计数异常隐窝（aberrant crypt，AC）的个数，并取正面图像。AC的诊断标准［8］：（1）异常隐窝所占面积约是周围正常隐窝的2～3倍；（2）异常隐窝的表皮层增厚；（3）异常隐窝的开口往往轻度变长；（4）与正常隐窝之间的间隔区相比，异常隐窝与正常隐窝之间的间隔区增大。

2.3.3 结肠病理改变的观察将固定好的结肠流水冲洗24 h后放置生物脱水机进行梯度脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（厚度4μm），行常规HE染色，封片。光镜下观察结肠黏膜组织形态学改变情况。组织学损伤评分标准见表2［9］。

表2 结肠病理组织学损伤评分标准

2.3.4 上皮内瘤变的评价标准［10］低级别上皮内瘤变指结构和细胞学异常限于上皮的下半部，相当于轻度和中度异型增生；高级别上皮内瘤变则指结构和细胞学异常扩展到上皮的上半部，乃至全层，相当于重度异型增生和原位癌。

2.3.5 一般情况的观察自实验开始每周一次观察各组小鼠的摄食摄水量、毛发、体质量、便血及死亡等变化。

3 结果

3.1 肉眼观察结肠黏膜损伤情况正常小鼠组结肠黏膜光滑，未见充血，水肿及糜烂溃疡改变；模型组、低剂量组小鼠结肠肉眼改变均以散在、多发性息肉状隆起性病变为主，组间比较无显著差异（P＞0.05）；中剂量组以伴有单发或少数息肉状隆起性病变为主，偶见溃疡形成，中剂量组与模型组和低剂量组之间比较，有显著差异（P＜0.05）。高剂量组、柳氮磺吡啶组均以结肠黏膜充血、水肿为主，未见明显溃疡。与模型组比较有极显著差异（P＜0.01），组间比较无显著差异（P＞0.05），与中剂量组比较有差异（P＜0.05），见表3。

3.2 小鼠结肠黏膜光镜下病理变化正常组小鼠结肠黏膜上皮完整，未见充血水肿及糜烂溃疡，腺体排列规则，含多量杯状细胞；模型组、低剂量组小鼠均以腺体增生、杯状细胞消失，异常隐窝呈不规则分支，以低和/或高级别上皮内瘤变为主，组间无显著差异（P＞0.05）。中剂量组以增生性息肉改变为主，杯状细胞明显减少，异常隐窝偶见。中剂量组与模型组和低剂量组之间比较，有显著差异（P＜0.05）；高剂量组、柳氮磺吡啶组镜下改变均以黏膜上皮脱落、杯状细胞减少，腺体增生为主，未见糜烂溃疡及明显的异常隐窝和上皮内瘤变，与模型组比较有极显著差异（P＜0.01），组间无显著差异（P＞0.05）、与中剂量组比较有差异（P＜0.05）。见表3、图1。

表3 小鼠结肠黏膜肉眼及光镜下损伤评分（）

注：与模型对照组比较，*P＜0.01

只肉眼损伤评分光镜损伤评分正常对照组组别小鼠/ 8 0 0模型对照组 8 9.00±0.75 8.25±1.03尼如哈优化剂高剂量组 8 3.00±1.75 3.13±0.53*尼如哈优化剂中剂量组 8 2.50±1.75 5.75±0.46*尼如哈优化剂低剂量组 8 2.50±1.00 5.18±1.19*柳氮磺吡啶组 8 2.50±1.75 5.13±0.75*尼如哈传统剂量组 8 3.00±0.73 5.12±0.64*

图1 尼如哈优化剂对结肠炎相关性结肠癌小鼠结肠黏膜癌变的影响

3.3 形态学改变及异常隐窝变化（ACF）结果正常组小鼠结肠未见异常隐窝。模型组可见隐窝开口呈三角、长椭圆等形状并扩大；其大小不等，多数含3个以上的AC；隐窝间脊增宽，异常隐窝与周围正常隐窝界限分明。隐窝上皮细胞胞核核分裂多、排列拥挤、增大扩展至肠腺的腔面，胞浆深染（图2），治疗组形成形态学改变及异常隐窝的平均数量均少于模型组，且多为异型性小形态学改变及异常隐窝。高剂量组，柳氮磺吡啶组偶见增生性隐窝，异常隐窝数明显减少，高剂量组、柳氮磺吡啶组与模型组比较有极显著差异（P＜0.01）见表4、图2。

表4 各组小鼠结肠形态学改变及异常隐窝形成情况（）

注：与模型对照组比较，*P＜0.01

组别小鼠/只每鼠平均ACF/个正常对照组80模型对照组 8 17.75±2.23尼如哈优化剂高剂量组 8 5.53±2.50*尼如哈优化剂中剂量组 8 6.45±1.56*尼如哈优化剂低剂量组 8 5.55±1.75*柳氮磺吡啶组 8 5.53±2.55*尼如哈传统剂量组4.52±1.75 8

3.4 小鼠一般情况正常组小鼠情况良好，摄食量多，大便正常；模型组小鼠体质量逐渐减轻，倦怠拱背、精神萎靡、体毛黯淡无光，有黏液血便，并出现脱肛，尼如哈治疗组的小鼠体质量和食量不同程度增加，体毛较有光泽，血便次数明显减少。

4 讨论

4.1 溃疡性结肠炎相关癌的发生、发展是一个多步骤演变的模式。研究显示，溃疡性结肠炎患者结肠上皮高级别或低级别内瘤变是发生在进展期结肠癌前，被认为是癌前病变［11］。在病程长，病变累及全结肠的溃疡性结肠炎患者结肠上皮癌变的危险性增加［12］。对高风险的患者使用疗效好且毒副作用较小的天然合成药物进行干预，可达到逆转癌前病变、降低肿瘤的发生率并能避免手术治疗后的复发率［3］。

4.2 蒙医认为，该病是由大肠 “宝如”病迁延不愈而引发的大肠 “血痞”病。而 “宝如”为热邪积于大肠而引起的聚会性慢性病［13］，久病致痞。应用内服药和肠疗-尼如哈疗法防治该病，取得了良好疗效，积累了宝贵的治疗经验［14-15］。

图2 尼如哈优化剂对结肠炎相关性结肠癌小鼠形态学改变及异常隐窝形成的影响

4.3 尼如哈优化剂是笔者通过前期工作，基于对大肠宝如病的病因病机的重新认识，结合蒙医理论与现代药理学研究，对包括原方在内的治疗大肠宝如病的尼如哈剂进行了优化，得出的以诃子、石榴、荜茇、枇杷叶、茜草、藜芦、秦艽花、大黄等组成的方剂。方中诃子为蒙药药中之王［16］。研究证明，其提取物具有抗菌、抗病毒等多种药理活性［17］。藜芦、大黄、秦艽花［18］以及茜草、枇杷叶［19］也具抗炎、抗菌、抗病毒等药理作用。荜茇、大黄、秦艽还具有抗氧化作用以及免疫调节作用［20］。通过实验我们可以明确尼如哈优化剂防治溃结癌变的生物学效应。由此初步推测，对高危险因素的患者应用尼如哈优化剂可预防溃结相关癌变是有力的，具有深入研究的价值。

4.4 蒙医药是传统实践经验的总结，理论基础和所用的药物与西医有着很大的不同。治疗结肠炎相关性结肠癌方面有独特的疗效，在许多方面可补西医之不足。随着临床上蒙西医结合的广泛开展，更加突出了蒙医药在治疗结肠炎相关性结肠癌的重要地位。

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R285.5

1001-1528（2015）04-0883-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.044