几种灰兜巴提取物配伍对α-葡萄糖苷酶抑制作用的影响

李知敏， 孙彦敏， 彭 亮， 刘 瑶， 杜 贺

（江西科技师范大学药学院，江西南昌330013）

几种灰兜巴提取物配伍对α-葡萄糖苷酶抑制作用的影响

李知敏， 孙彦敏， 彭 亮*， 刘 瑶， 杜 贺

（江西科技师范大学药学院，江西南昌330013）

目的研究中药灰兜巴石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取部分、醇提萃取剩余部分和水提部分5部分对于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。方法通过高效液相色谱法检测不同灰兜巴提取物单因素及相互配伍后对于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。结果灰兜巴各部分提取物均表现出良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，不同比例提取物配伍后对于α-葡萄糖苷酶的抑制作用明显升高，通过DPS数据分析可得出，灰兜巴乙酸乙酯部分对于α-葡萄糖苷酶的抑制作用最强，配伍后最优化实验的抑制率可高达98.62%。结论证明灰兜巴具有良好的降糖疗效，且相互配伍有助于增强对于α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

灰兜巴；α-葡萄糖苷酶；配伍；抑制活性；高效液相色谱

糖尿病是由于糖类物质新陈代谢变动导致胰岛素分泌受限而使得血糖过高引起的。近年来，糖尿病患者长期血糖过高的状态会导致眼、肾、心血管以及神经系统障碍，引起多种并发症［1］。糖尿病及其并发症所导致的死亡率已超越癌症和其他疾病［2］。临床上治疗糖尿病的药物通常价格昂贵且副作用大［3］，因此从天然药物中寻找一种简单有效、安全的药物受到越来越多的人的关注。α-葡萄糖苷酶抑制剂作为一种新型抗糖尿病方法近几年来常被用来治疗糖尿病。临床上有阿卡波糖和伏格列波糖［4］作为α-葡萄糖苷酶抑制剂用来延迟葡萄糖吸收，前人实验［5-6］证明中药抑制α-葡萄糖苷酶可有效治疗糖尿病。灰兜巴又名闭口袋，曾经被认为是一种山蜘蛛寄生在海拔1 500 m以上的峨眉山老茶树头部生长出来的菌科植物［7］，后经鉴定确认该药材为地蛛科地蛛属卡氏地蛛（Atypus karschi Doenitz）在老茶树根部所筑的巢穴。作为一种民族药，灰兜巴已经近千年来被峨眉山地区居民用于糖尿病的预防及治疗。其有“仙山灵药”、“糖尿病克星”和 “天然纯绿色的大自然珍宝”［8］的美誉。

不管是单种中药还是中药复方，其临床疗效都是通过活性成分或活性成分群产生的［9］。所谓 “中药组效关系”（combination-activity relationship，CAR）是指在不同层次上的中药物质相互组合与药效活性之间的关联［10］。本实验中采用HPLC分析传统民族药灰兜巴提取物各配伍比例中对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。将灰兜巴提取部位加以配伍组合，观察在酶抑制上是否有增强作用及何种比例获得最佳效果，并通过DPS数据处理系统进行极差方差分析，研究灰兜巴不同提取部位的活性差异。从中药材成分组合物质基础和药效相关性方面，为传统中药方剂学配伍原理、组方分析和药物治疗等方面提供实验依据。

1 材料与仪器

1.1 实验材料 灰兜巴购自于峨眉山灰兜巴批发零售中心。并实地采集民间习称的山蜘蛛，经江西农业大学农学院熊志华老师鉴定，确认该蜘蛛实为地蛛科地蛛属的卡氏地蛛Atypus karschi Doenitz，而灰兜巴则为卡氏地蛛于老茶树根部所筑的巢穴。

1.2 实验试剂 α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）及还原型谷胱甘肽均为美国Sigma公司产品；对硝基苯酚 （PNP）购自于上海源叶生物科技有限公司；无水碳酸钠（Na2CO3）、二甲亚砜（DMSO）、pH 6.8磷酸钾 （PBS）缓冲液、甲酸、无水乙醇、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等试剂均为国产分析纯，甲醇，乙腈为色谱纯。

1.3 实验设备 Agilent 1100高效液相色谱仪（安捷伦有限公司）；Vortex-Genie2涡旋振荡器（美国Scientific Industries公司）；LR 4000旋转蒸发仪 （德国海道夫公司）；FA2004N电子天平 （上海精密科学仪器有限公司）；XS203S电子精密天平 （瑞士梅特勒-托利多公司）。

2 实验方法

2.1 HPLC分析色谱条件 Kromasil 100-5 C18（4.6 mm× 250mm，5μm）色谱柱；Agilent C18（4.6 mm×12.5 mm，5μm）保护柱；流动相A为乙腈，流动相B为含0.1%甲酸的水溶液，梯度洗脱 （0～8 min，20%～30%A；8～13 min，30%～80%A；13～18 min，80%～20%A；18～28min，20%A）；体积流量1.0 mL/min；进样量20μL；柱温25℃；检测波长314 nm。

2.2 高效液相法测定灰兜巴对α-葡萄糖苷酶抑制活性

取灰兜巴醇提液分别用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取得到灰兜巴石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、正丁醇萃取物，醇提萃取剩余物，灰兜巴醇提后滤渣用水提得灰兜巴水提物。

取一支试管，依次加入67 mmol/L pH 6.8的磷酸钾缓冲液1.0 mL，3 mmol/L谷胱甘肽溶液0.2 mL，0.04 mg/ mLα-葡萄糖苷酶溶液0.3 mL，灰兜巴各部分提取物0.3 mL，涡旋振荡器混匀，37℃水浴保温10 m in后，加入0.2 mg/m LpNPG溶液0.5 mL，涡旋振荡器混匀，反应每2 min震荡5 s，10 min后，再加入0.1 mol/L碳酸钠溶液8 mL终止反应，反应后溶液过0.45μm微孔滤膜后，用HPLC按“2.1”项条件进行检测，将PNP峰面积记为A1。

另取一试管，不加实验样品溶液，实验步骤同上，将PNP峰面积记为A2。按下面公式计算灰兜巴不同提取部分对于α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

α-葡萄糖苷酶抑制率：

酶活性抑制率=（A2-A1）/A2×100%

2.3 灰兜巴各提取部分测定α-葡萄糖苷酶抑制活性单因素研究 分别取0.06、0.07、0.08 mg/mL质量浓度的灰兜巴石油醚萃取物；0.05、0.06、0.07 mg/mL质量浓度的灰兜巴乙酸乙酯萃取物；0.1、0.2、0.3 mg/mL质量浓度的灰兜巴正丁醇萃取物；0.5、1.0、2.0 mg/mL质量浓度的灰兜巴醇提萃取剩余物；0.5、1.0、2.0 mg/mL质量浓度的灰兜巴水提物。按 “2.2”项中反应条件进行反应并计算其各部分对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。

2.4 灰兜巴各提取部分测定α-葡萄糖苷酶抑制活性不同比例配伍研究 为考察各灰兜巴提取物不同质量浓度配比后，对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，设计五因素四水平正交试验，因素和水平安排见表1。试验按照L16（45）正交表进行，由于试验表中无空白列，故每组实验重复进行3次，试验结果用DPS 13.5统计分析软件进行极差分析和方差分析。

表1 因素水平

3 实验结果

3.1 方法学验证

3.1.1 线性关系考察 精密称取0.020 9 g PNP标准品，用磷酸盐缓冲溶液超声溶解，定容于25 mL量瓶中，配制成6 mmol/L的PNP母液，将母液分别稀释成0.002 5、0.005、0.01、0.05、0.1mmol/L。

将上述不同浓度的PNP标准品按照 “2.1”项中色谱条件测定，以峰面积为横坐标，浓度为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程为y=6 599.6x+1.273 4，r2= 0.999 8，说明PNP在0.002 5～0.1 mmol/L浓度范围内线性关系良好。

3.1.2 精密度试验 精密吸取0.1 mmol/L PNP溶液20 μL，连续进样6次，记录HPLC图。并计算其峰面积的RSD值为0.295%，表明仪器精密度良好。

3.1.3 稳定性试验 精密吸取0.1 mmol/L PNP溶液，分别在0、1、2、3、4、5、6 h不同时间进样20μL，记录峰面积，计算其RSD值，检测PNP的稳定性。其RSD值为0.65%，证明PNP在此条件下稳定性良好。

3.1.4 重复性试验 在相同条件下重复制备样品6次，按“2.1”项中色谱条件检测，其RSD值为0.79%，表明此反应条件操作可重复性较好。

3.1.5 回收率试验 不加反应药液，将α-葡萄糖苷酶替换为PNP标准溶液做阴性对照，取样量分别为0.3 m L的60%、80%、100%、120%、140%，实验测得回收率分别为 98.08%、101.13%、100.97%、99.24%、101.29%，RSD值为1.42%，由此证明标准曲线准确性良好。

3.2 灰兜巴各提取部分测定α-葡萄糖苷酶抑制活性单因素研究 按 “2.1”项中反应条件检测灰兜巴不同质量浓度各提取部分的α-葡萄糖苷酶抑制活性，在13.9 min出现PNP峰，以峰面积计算α-葡萄糖苷酶抑制率，实验数据见 表2。

表2 灰兜巴各提取部分单独作用时测定α-葡萄糖苷酶的抑制率 （%，，n=5）

表2 灰兜巴各提取部分单独作用时测定α-葡萄糖苷酶的抑制率 （%，，n=5）

L 2.0mg/mL石油醚萃取物 — 14.65±2.80 30.21±4.32 54.80±1.63萃取物类别 0.05 mg/mL 0.06 mg/mL 0.07mg/mL 0.08 mg/mL 0.1mg/mL 0.2 mg/mL 0.3 mg/mL 0.5 mg/mL 1.0 mg/m——————乙酸乙酯萃取物 36.05±3.36 48.96±1.69 64.41±2.26 — — — — — — —正丁醇萃取物 — — — — 15.46±2.62 28.85±0.98 48.23±2.74 — — —醇提萃取剩余物 — — — — — — — 1.64±3.10 4.27±2.44 8.54±2.02水提物 — — — — — — —1.32±1.27 1.92±3.48 4.15±3.01

3.3 灰兜巴各提取部分测定α-葡萄糖苷酶抑制活性不同比例配伍研究 依据灰兜巴5种提取物的单因素实验结果，按照L16（45）正交试验设计表，进行试验，其对α-葡萄糖苷酶的抑制率和极差分析结果见表3，方差分析见表4。

表3 灰兜巴各提取部分测定α-葡萄糖苷酶抑制活性不同比例配伍研究

表4 灰兜巴提取物对α-葡萄糖苷酶抑制作用正交设计方差分析结果

由表3的极差分析结果可以看出，灰兜巴乙酸乙酯萃取物的极差最大，对α-葡萄糖苷酶的影响最显著，其次是石油醚萃取物、正丁醇萃取物和水提物，而醇提萃取剩余部分的影响最小。

由表4的方差分析可知，灰兜巴5部分提取物的P值小于0.01，证明这5种提取物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用均存在显著性差异，具有统计学意义。由极差分析结果和方差分析结果可知，灰兜巴提取物的最佳配比为A4B4C4D3E2，即灰兜巴石油醚萃取物0.08mg/mL、乙酸乙酯萃取物0.07 mg/mL、正丁醇萃取物0.3 mg/mL、醇提萃取剩余物1.0 mg/mL和水提物0.5 mg/mL。按照该配比进行验证试验，α-葡萄糖苷酶的抑制率为98.62%±0.15%（试验重复3次）。

4 讨论

中药起药效作用的特点为多种成分共同相互作用，体现了传统中药与西药的主要区别。中药组效关系旨在研究中药的有效成分相互配伍与其药效之间的关系，对于揭示中药多指标的质量控制和中药的作用特点有着重要意义［11］。

前期试验中已证实灰兜巴各个提取部分单独使用时对α-葡萄糖苷酶存在抑制作用，本实验主要以HPLC为检测手段，以PNP作为检测峰［12］，考察了中药灰兜巴不同提取物按不同比例相互配伍后，对α-葡萄糖苷酶的抑制作用的影响，研究灰兜巴中各种成分之间的相互影响作用。在正式试验前，笔者用HPLC检测了在不加α-葡萄糖苷酶条件下，反应液的HPLC图，结果表明在PNP的保留时间（13.9min）处没有峰出现，证明灰兜巴各提取物在反应条件下不会对试验结果的检测产生干扰。

正交试验结果表明，灰兜巴提取物配伍后，其α-葡萄糖苷酶抑制率较单种提取物均明显升高，证明灰兜巴各提取部分配伍后对α-葡萄糖苷酶的抑制作用增强。但与各提取物单独作用于α-葡萄糖苷酶后的抑制率之和相比，配伍后的抑制率明显降低，如正交试验中的第7组试验，0.06 mg/mL的石油醚萃取物、0.06 mg/mL的乙酸乙酯萃取物、0.3mg/mL正丁醇萃取物和0.5 mg/mL的水提物组合后，α-葡萄糖苷酶的抑制率平均值为93.04%，而根据单因素试验结果，这4种提取物相应浓度的抑制率之和为113.25%，即理论上，如果这四种提取物同时存在时，应该完全抑制α-葡萄糖苷酶的活性。出现这种情况的原因，可能是由于中药在人体内起作用是一个多成分、多靶点［13］的过程，而本实验中选用的α-葡萄糖苷酶抑制模型，是药物单靶点作用，各提取物的成分在抑制α-葡萄糖苷酶活性的过程中存在竞争性抑制，从而使配伍后的抑制率反而降低。这个结论提示，在研究中药的组效关系时，药理模型应尽量避免选择作用靶点单一的模型，最好选用离体细胞或是整体动物等存在多靶点的模型。

综上，灰兜巴作为一种民族药，可通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性发挥其降糖作用，经组效配伍后其抑制作用明显增强，证明灰兜巴中各成分之间存在相互作用且有利于增强药物对酶的抑制作用。对于研究糖尿病的预防和治疗具有十分重要的意义，且具有广阔的市场前景。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0879-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.043

2014-02-27

江西省青年科学基金 （20122BAB215019）

李知敏 （1980—），女，硕士，讲师，从事中药药效物质基础方向研究。Tel：13732967677，E-mail：Lzmin3026@163.com

*通信作者：彭 亮 （1980—），男，博士，副教授，从事中药药效物质基础方向研究。Tel：13576033885，E-mail：pengliang8036@ 163.com