低氧环境下黄芪注射液对人骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

侯 茜， 张秋菊， 刘永琦， 张 帆

（甘肃中医学院，甘肃兰州730000）

低氧环境下黄芪注射液对人骨髓间充质干细胞体外增殖的影响

侯 茜， 张秋菊， 刘永琦， 张 帆

（甘肃中医学院，甘肃兰州730000）

目的探讨低氧环境下黄芪注射液对人骨髓间充质干细胞 （hMSCs）体外增殖的影响。方法将体外培养的hMSCs分成常氧组和低氧组，分别用0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、1 000μg/mL的黄芪注射液干预48 h，采用倒置相差显微镜观察细胞形态，四甲基偶氮唑盐 （MTT）法检测细胞的增殖情况。结果低氧环境下，25、50、100、150、200μg/mL的黄芪注射液均可明显促进hMSCs的增殖 （P＜0.01），其中50μg/mL黄芪注射液的增殖效果最显著（P＜0.01），达600μg/mL时产生抑制作用；常氧环境下，黄芪注射液以300μg/mL对hMSCs的促增殖作用最为明显 （P＜0.01），25、50、100、150、200、600、1 000μg/mL黄芪注射液均抑制hMSCs的增殖。结论黄芪注射液在一定质量浓度下可促进体外培养的hMSCs的增殖。低氧环境下，低质量浓度促进其增殖；常氧环境下，低质量浓度抑制其增殖。

黄芪注射液；人骨髓间充质干细胞 （hMSCs）；低氧培养；增殖

人骨髓间充质干细胞（human bonemarrow-derived mesenchymal stem cells，hMSCs）具有自我更新能力和多向分化潜能，将其作为种子细胞用于基因治疗和细胞治疗已成为当前研究的热点。hMSCs主要来源于骨髓，在骨髓内的氧浓度为1%～7%之间［1］，是一种生理性的低氧环境，hMSCs移植后治疗效能的发挥也与损伤部位的低氧环境密切相关。但目前hMSCs体外培养和增殖分化的研究大多是在常氧条件下进行的，忽视了体内一些生理、病理状态中，出现细胞局部微环境低氧的真实情况。如何在体外低氧环境下促进hMSCs的增殖、分化，是目前hMSCs研究的重点和难点。

黄芪是一味历史悠久、临床上最常用的 “扶正固本，补中益气”的中药，具有增强机体免疫力、降血糖、抗应激、抗肿瘤、抗病毒、抗辐射等多种功效。近年来，有关研究提示黄芪与hMSCs间有密切关系［2-4］，少量研究结果表明黄芪具有调控hMSCs增殖、分化和迁移的作用［5］。但低氧环境下黄芪注射液对人骨髓间充质干细胞体外增殖的影响尚未见报道。本实验将传统中医药理论与干细胞研究相结合，在低氧环境下用中药黄芪干预hMSCs培养过程，采用倒置相差显微镜观察细胞形态，MTT法检测细胞增殖，探讨低氧环境下黄芪对hMSCs体外增殖的影响，为临床治疗运用黄芪注射液提供科学依据。

1 材料

1.1 细胞株 人骨髓间充质干细胞（human bonemarrowderived mesenchymal stem cells，hMSCs），购自Cyagen Biosciences Inc（Catalog Number：HUXMA-01001）。

1.2 试剂 DMEM/F12培养基（HYCLONE NYB0813），0.25%胰蛋白酶 （GIBCO 20130708217）；胎牛血清 （HYCLONE NXA0544）；四甲基偶氮唑盐（MTT）（索莱宝科技有限公司 0793）；二甲基亚砜 （索莱宝科技有限公司0231）；黄芪注射液 （神威药业集团，10mL黄芪注射液相对于原药材20 g）。

1.3 仪器 三气培养箱 （力康发展有限公司HF-100），二氧化碳培养箱（日本SANYO MCO-18AIC（UV））；超净工作台 （天津市泰斯特仪器有限公司CJ-2S）；倒置相差显微镜（日本OLYMPUS IX81）；酶联免疫检测仪（美国BIORAD IMARK1509）；往复式水浴摇床 （上海智诚分析仪器制造公司ZHEY-110X30）等。

2 方法

2.1 hMSCs体外培养 将hMSCs传于25 cm培养瓶中，每瓶3 m L。用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。24 h后更换新鲜培养液，去除未贴壁细胞，以后每2天换液1次。当细胞融合度约达80%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代。倒置相差显微镜观察传代细胞生长情况和形态。

2.2 实验分组 将体外培养的hMSCs分为常氧组和低氧组。常氧组置于37℃、5%CO2培养箱 （21%O2）中培养；低氧组置于37℃、三气培养箱 （5%O2）中培养。黄芪注射液分为：0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、1 000μg/mL十一个剂量。

2.3 MTT比色法检测hMSCs增殖 将培养的hMSCs，用0.25%的胰蛋白酶消化制备成单细胞悬液，调整其细胞密度为2×104个/mL，接种于96孔培养板，每孔含细胞悬液100μL。按实验分组分别置37℃、5%CO2培养箱及37℃、三气培养箱培养48 h后，分别加入0、25、50、100、150、200、300、400、500、600、1 000μg/mL的黄芪注射液干预48 h。终止前4 h，各组于每孔加5 mg/mL MTT20μL，继续孵育4 h，弃除孔内上清液，每孔加入二甲基亚砜150μL，将培养板置水平摇床上，低速震荡20 m in使沉淀充分溶解后，选择570 nm波长，在酶联免疫检测仪测量吸光度OD值。实验重复3次。

2.4 统计学处理 应用SPSS 20.0统计软件进行分析。所得数据以均数±标准差 （）表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 hMSCs形态学观察 倒置相差显微镜观察细胞形态变化，可见hMSCs培养24 h后开始贴壁，3 d后细胞增多，形态均一，为成纤维细胞样，呈梭形或纺锤形生长。6～7 d后细胞聚集生长，以长梭形为主，细胞分布均匀，排列有序，边界清晰，旋涡样生长。常氧和低氧环境下的hMSCs的形态无明显区别。

3.2 MTT比色法检测hMSCs增殖结果 常氧环境下，黄芪注射液质量浓度在25～200μg/m L范围内变动时，均抑制hMSCs的增殖（P＜0.01），300μg/m L的黄芪注射液对hMSCs具明显促增殖作用 （P＜0.01），随质量浓度增大时增殖作用降低，当质量浓度达600、1 000μg/mL时产生抑制作用 （P＜0.01），见图1。低氧环境下，25、50、100、150、200μg/mL的黄芪注射液均可明显促进hMSCs的增殖（P＜0.01），其中以50μg/mL黄芪注射液的增殖效果最显著 （P＜0.01），当质量浓度达600、1 000μg/mL时产生抑制作用 （P＜0.01），见图2。

图1 常氧下 （21%氧浓度）不同质量浓度黄芪注射液对hMSCs增殖的影响

图2 低氧下 （5%氧浓度）不同质量浓度黄芪注射液对hMSCs增殖的影响

4 讨论

hMSCs主要来源于骨髓，骨髓是一典型的低氧环境，有学者将hMSCs的生长环境归于生理性低氧。除正常的生理性低氧外，一些病理性的情况也往往造就低氧环境，动员hMSCs聚集修复的损伤组织如骨坏死、心肌梗塞处，因为缺血缺氧使得病变组织长期处于低氧环境，而hMSCs移植后治疗效能的发挥也与损伤部位的低氧环境密切相关。hMSCs正是归巢于这样的低氧环境中，分化成熟，修补缺损，弥补功能［6］。可见hMSCs在自然所处的环境中以低氧为主，低氧是其在正常生理状态下或某些病理状态中所处环境的一个基本要素。

国内外关于中药黄芪干预hMSCs，对其增殖的影响研究不多。胡琳等［7］体外加黄芪注射液 （药物浓度梯度为：原液，5、10、15、20倍液）培养大鼠hMSCs24、48 h，结果发现黄芪注射液对hMSCs的增殖无显著作用。谭艳芳等［8］加入不同浓度的黄芪甲苷与大鼠hMSCs共培养24、48、72 h后，结果以200 mg/mL黄芪甲苷组72 h增殖作用最明显 （P＜0.05）。黄进等［9］研究表明，黄芪多糖对体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞，经72 h诱导培养后，有促进增殖的作用。其中，以1 mg/mL黄芪多糖促增殖作用最为明显（P＜0.01），2、3 mg/mL黄芪多糖也具有促进hMSCs增殖的作用（P＜0.05），而5 mg/mL黄芪多糖组hMSCs增殖最少。本课题组通过MTT比色法分析不同质量浓度黄芪注射液对体外培养的hMSCs增殖的影响，结果发现低氧环境下，低质量浓度的黄芪注射液促进hMSCs的增殖，以50μg/mL黄芪注射液培养hMSCs能表现出更加旺盛的增殖能力 （P＜0.01）；常氧环境下，低质量浓度的黄芪注射液抑制hMSCs的增殖，300μg/m L的黄芪注射液对hMSCs具明显促增殖作用 （P＜0.01）。

黄芪是补益药物中应用最为广泛的中药，也是许多中药复方中的主药。黄芪性温味甘，入肺、归脾经，生用能益卫固表、托毒生肌、利水消肿；炙用能补中益气、升阳举陷。目前对黄芪药材及含君药黄芪的中成药的质量评价均以黄芪皂苷Ⅳ （黄芪甲苷）作为评价的指标［10］。药理研究表明，黄芪注射液中主要有黄芪皂苷、黄芪酮、黄芪多糖3种不同的化学成分［11］，具有一定免疫调节、抗病毒、抗氧化、抗突变、抗肿瘤等作用。我国 《本草纲目》记载黄芪可治疗一切气衰、血虚之证。干细胞具先天之精属性，是先天之精在细胞层次的存在形式［12-14］，中医理论认为“气能生血”、“精血同源”，黄芪补气、生髓、化血，这为促进hMSCs体外增殖提供了理论依据。

本研究只是初步探索了低氧条件下黄芪注射液对人骨髓间充质干细胞体外增殖的影响，并且未能以黄芪中提取而得的黄芪皂苷作为平行对照。低氧培养也只用5%的氧气，未用3%的氧气培养，继续降低氧浓度是否可增加细胞增殖等，还有待于进行更深入的研究。

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R285.5

B

1001-1528（2015）04-0873-03

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.041

2014-01-29

甘肃中医学院中青年科研基金项目 （BH2012-035）

侯 茜（1984—），女，硕士，讲师，主要从事中医药基础研究。Tel：（0931）8765414，E-mail：houqian@gszy.edu.cn