芪归益肾方对阿霉素肾病大鼠肾功能保护作用的实验研究

魏明刚， 程宗琦， 刘 蔚， 顾冬梅， 李凤玲， 陆 迅， 陈 琳， 杨彦裕

（苏州大学附属第一医院中西医结合科，江苏苏州215006，）

芪归益肾方对阿霉素肾病大鼠肾功能保护作用的实验研究

魏明刚， 程宗琦， 刘 蔚， 顾冬梅， 李凤玲， 陆 迅， 陈 琳， 杨彦裕

（苏州大学附属第一医院中西医结合科，江苏苏州215006，）

目的验证中药方剂芪归益肾方在延缓肾脏纤维化方面的功效。方法芪归益肾方由黄芪、当归和川芎等药物按照一定的比例关系所组成，观察方剂对阿霉素肾病大鼠的治疗作用。结果通过本研究发现 “芪归益肾方”可以有效地减少阿霉素肾病大鼠尿蛋白的漏出和降低尿NAG的表达水平。通过肾脏组织的免疫组织化学对TGF-β1、TIMP-1和MMP-2以及细胞外基质成分Col-Ⅰ和LN的表达情况进行分析，发现“芪归益肾方”具有调节纤维化相关细胞因子以及细胞外基质相应成分及代谢酶表达作用。结论传统中草药可以有效减轻阿霉素肾病大鼠的肾脏纤维化水平，从而达到延缓肾脏病变进展，保护肾功能的作用。

阿霉素肾病；肾功能保护；实验研究

在我国慢性肾小球肾炎仍是慢性肾脏病的主要病因，其主要的病变特点简而言之就是临床上表现为蛋白尿和病理上表现为肾脏不同程度的纤维化。因此，控制慢性肾小球肾炎病变的进展是肾脏病领域的核心问题之一。中草药在慢性肾小球肾炎的治疗上已有数百年的历史并积累了丰富的临床经验。但是，直到目前为止还没有一个行之有效且阐明治疗机制的方剂能够被临床所接受。课题组在以往实验和临床工作的基础上发明了 “加味当归补血汤”，并将方剂进一步改良后命名为 “芪归益肾方”［1-2］。希望通过本研究阐明该方剂治疗慢性肾小球肾炎的机制。阿霉素肾病大鼠是经典的慢性肾小球肾炎病变模型，该模型存在明显的肾小球和肾小管间质病变。单次尾静脉注射阿霉素造模在我们以往的研究中得到充分的验证［1］。阿霉素肾病模型大量尿蛋白和细胞外基质聚集的特点和肾脏病理改变与人类病变相一致。因此是国际上公认并用于实验研究慢性肾脏病的动物模型。研究发现，细胞外基质异常降解和聚集是导致肾脏损害以及肾脏纤维化病变的核心问题［3］。基质金属蛋白酶 （MMP）是一组锌依赖的蛋白水解酶，其对细胞外基质 （ECM）具有直接的作用并减少其在组织中的聚集，减轻组织纤维化的程度。而金属蛋白酶组织抑制剂（TIMP）抑制MMP的活性，影响ECM的降解。研究发现，MMP的成员MMP-2在肾脏组织的ECM降解中起到关键作用［4-5］。

1 实验过程及方法

1.1 药物和材料 芪归益肾方由黄芪、当归、川芎等组成，药品购自苏州天灵药业股份有限公司；洛丁新 （贝那普利）由北京诺华制药有限公司制造；阿霉素 （ADR）由深圳万乐药业股份有限公司制造。其他与本研究相关的实验试剂均为分析纯。

芪归益肾方的制备 将黄芪、当归与川芎等药物按照一定的比例制备成混悬液，混悬液的药物质量浓度为1 g/mL，在苏州大学附属第一医院制剂室进行药材鉴定并制备。贝那普利 （ACEI）作为阳性对照应用于本研究。

1.2 实验动物和给药方式 32只雄性SD大鼠（140±10）g，购自中国科学院上海斯莱克实验动物中心 （SCXK（沪）2012-0002），它们被安置在标准的温度条件下 （23 ±1）℃、相对湿度 （55±10）%和12 h光/12 h暗周期，可以随意获得食物和水。应用随机数字表的方法分为4组：正常对照组、模型组、贝那普利组和芪归益肾方组，每组8只。除了正常对照组，其他组大鼠均通过尾静脉注射给予阿霉素 （7.5 mg/kg）。实验动物的所有程序都由苏州大学附属第一医院伦理学委员会批准。

大鼠灌胃治疗包括清洁饮用水、贝那普利或芪归益肾方给予对应组别的大鼠，治疗时间为8周，每天1次。贝那普利和芪归益肾方使用与人类等效剂量的药物，分别是10 mg/（kg·g）、10 mL/（kg·d）和1 g/（kg·d）、2 mL/（kg·d）。芪归益肾方的剂量选择依据对应于在我们的初步实验中抑制TGF-β1mRNA的表达最低有效剂量［1］。相对于贝那普利或芪归益肾方，模型组给予相同体积的清洁饮用水。在实验期间每2周对各组大鼠称定质量并记录。在为期8周的实验结束时摘除大鼠肾脏。

1.3 尿液和血液检测 大鼠在实验研究的第7、28、42、56天被置于代谢笼收集24 h尿液，在此期间并不改变大鼠的进食和饮水习惯，收集尿液以便检测24 h尿白蛋白排泄和尿NAG酶等项目。收集的尿液样本 （5 mL）在室温条件下离心机离心5min收集上清液并储存在-80℃超低温冰箱直到测试。血液 （2～3 mL）的获得方法主要是通过在实验研究的第7、28、42、56天眼眶静脉取血的方法，然后血液在室温条件下离心10 min后收集血清并储存在-80℃超低温冰箱中以便测定血清白蛋白 （SAL）、血液尿素氮 （BUN）等项目。生化指标的检测在自动生化分析仪上进行（OLYMPUSAU-5400，日本）。

1.4 肾脏样品制备 大鼠脱颈椎处死后立即对两侧肾脏进行移除并除去肾脏外部的包膜，然后对肾脏称定质量。进行肾脏/身体 （K/B）质量比的测定。肾脏使用4℃冷生理盐水清洗，至少3次，然后使用滤纸擦干。

1.5 TGF-β1、MMP-2、TIMP-1、Laminin（LN）和collagen I（Col-I）肾脏组织的免疫组织化学分析 这个过程是应用免疫组织化学中标准的SP染色方法。具体的方法是将肾组织样本固定在10%中性甲醛中，酒精脱水后加入石蜡包埋。按照标准切片 （4μm）制备组织玻璃切片。3%H2O2室温孵育以消除内源性过氧化物酶的活性。蒸馏水冲洗，PBS液浸泡。切片放入盛有抗原修复液 （工作液）的容器中，电炉上加热煮沸，室温冷却，蒸馏水冲洗后PBS液洗涤。5%～10%正常山羊血清 （PBS液稀释）封闭非特异性抗原，要完全覆盖组织表面，室温孵育。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育或4℃过夜。PBS液冲洗，滴加适当比例稀释的生物素标记二抗，37℃孵育后滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素，DAB染色，避光，显微镜观察。复染：在苏木素下45 s至 1 min。分别使用TGF-β1，MMP-9，TIMP-1，Col-I和LN单克隆抗体过夜，脱水透明，中性树胶封片。光镜下观察。观察方法：棕色或者棕褐色着色面积作为阳性面积。应用计算机医学病理图象分析系统对肾脏组织切片的免疫组织化学染色的结果进行分析，在400倍光学显微镜下每个组织切片采集30个不重叠视野中的阳性染色面积，然后计算每个视野内的染色区域的平均光密度数值，将数据汇总，应用SPSS统计分析软件进行分析。

2 结果

2.1 阿霉素肾病大鼠的行为学表现 在实验过程中，正常对照组所有的大鼠存活并表现出正常的行为与光滑的毛皮以及体质量增加。其他组的大鼠均表现出不同程度的进食下降和头发光泽度下降，昏睡和缺乏活动，并有腹泻和体质量下降。

2.2 芪归益肾方对肾身体/质量比、血清白蛋白和血脂的影响 模型组与正常对照组比较，血清白蛋白水平显著下降且组间差异在造模早期就出现。使用贝那普利或芪归益肾方治疗可以部分恢复血清白蛋白水平，治疗后8周组间比较具有统计学意义。在实验的56 d，模型组与对照组K/ B质量比也可以看出明显不同。贝那普利治疗或芪归益肾方可以明显降低这个比率，这种改变相对模型组的组间比较同样具有统计学意义 （P＜0.05，表1）。

表1 各组大鼠肾身体/质量比 （K/B）、血清蛋白和血脂情况（）

表1 各组大鼠肾身体/质量比 （K/B）、血清蛋白和血脂情况（）

组别 动物数/只 （K/B）/（mg·kg-1）血清蛋白/（g·L-1）血脂/（mmol·L-1）8 3.46±0.19 21.92±0.85 0.64±0.22模型组 8 5.91±0.12 11.96±1.88 1.66±1.14贝那普利组 8 4.85±0.19 15.02±4.88 0.66±0.32芪归益肾组正常对照组8 4.31±0.28 14.78±2.65 0.52±0.30

2.3 芪归益肾方对24 h尿白蛋白和NAG酶的影响 模型组大鼠与正常对照组比较，其24 h尿蛋白定量的增加非常明显。贝那普利和芪归益肾方的尿蛋白定量水平下降明显，表明芪归益肾方扭转了尿蛋白持续增加的趋势，与模型组比较而言尿蛋白减少超过50%，组间比较具有统计学意义（P＜0.05，图1）。对于尿NAG酶而言，模型组与正常对照组比较其在42 d和56 d均增加非常明显。使用贝那普利和芪归益肾方干预治疗后大鼠NAG酶的水平在实验的42 d和56 d下降明显 （P＜0.05，图2）。

2.4 芪归益肾方对肾功能影响 治疗前后各组大鼠的肾功能如尿素氮组间比较无统计学意义 （P＞0.05，表2）。参考相关实验研究认为［1］，造模和治疗本身由于时间因素还未达到导致肾功能明显下降的程度。

图1 各组大鼠24 h尿蛋白定量变化趋势图

图2 各组大鼠尿NAG酶定量变化趋势图

2.5 芪归益肾方对肾组织Col-Ⅰ、LN、TGF-β1、MMP-2、 TIMP-1表达的影响 模型组中肾小球LN和Col-Ⅰ的表达明显高于其他组。应用贝那普利治疗或芪归益肾方治疗后，相对于模型组而言可以明显地减少Col-Ⅰ和LN的表达水平。而且芪归益肾方与贝那普利治疗结果相比较而言在减少Col-Ⅰ和LN的表达上组间差异具有统计学意义（P＜0.05，表3，图4～5）。

表2 各组大鼠造模后肾功能情况的动态监测 （）

表2 各组大鼠造模后肾功能情况的动态监测 （）

组别 动物数/只血清尿素氮定量检测/（mmol·L-1）1周 4周 6周 8周8 5.35±0.63 9.91±0.91 9.02±3.58 6.15±0.57模型组 8 5.63±0.63 9.86±0.60 7.07±4.14 5.17±0.42贝那普利组 8 6.16±0.71 10.61±1.77 6.60±0.81 7.66±1.75芪归益肾组正常对照组8 6.69±0.61 11.10±3.24 5.76±0.76 6.17±0.89

模型组肾小球中TGF-β1和TIMP-1的表达明显高于其他组。应用贝那普利治疗或芪归益肾方治疗后，相对于模型组而言可以明显地减少肾小球TGF-β1和TIMP-1的表达水平 （P＜0.05，表3，图6～7）。而且芪归益肾方与贝那普利治疗结果相比较而言在减少MMP-2的表达明显低于其他组，应用贝那普利治疗或芪归益肾方治疗后，相对于模型组而言可以明显地提高肾小球MMP-2的表达水平，且（P＜0.05，表3，图8）。

表3 实验第8周TGF-β1，MM P-2，TIMP-1，Col-Ⅰ和LN在肾组织的表达（）

表3 实验第8周TGF-β1，MM P-2，TIMP-1，Col-Ⅰ和LN在肾组织的表达（）

注：与模型组比较，*P＜0.05；与贝那普利组比较，△P＜0.05

LN正常对照组组别 动物数/只 TGF-β1 MMP-2 TIMP-1 Col-Ⅰ8 0.169±0.015 0.456±0.061 0.202±0.015 0.166±0.029 0.171±0.015模型组 8 0.4912±0.034 0.203±0.035 0.348±0.026 0.403±0.033 0.492±0.021贝那普利组 8 0.285±0.0421* 0.274±0.042* 0.273±0.038* 0.252±0.031* 0.293±0.034*芪归益肾组 8 0.187±0.026*△ 0.314±0.028*△ 0.240±0.030*△ 0.206±0.025*△ 0.215±0.019*△

图3 各组大鼠肾脏病理情况 （HE染色，×400倍）

图4 各组大鼠肾脏病理情况 （Col-Ⅰ，×400倍）

3 讨论

肾小球和肾小管间质纤维化是慢性肾小球肾炎的主要病理学表现，ECM聚集是其主要的原因之一［6］。蛋白尿是引起慢性肾脏病患者肾功能下降的一个独立危险因素［7］，而尿NAG酶是用来检测肾小管损伤的敏感标志物［8］。控制尿蛋白的治疗，尤其是使用血管紧张素转换酶抑制剂（ACE）或血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂 （ARB）一直被认为是有利于肾脏保护的重要环节［9］。然而，上述药物对肾小管却无任何保护作用。

图5 各组大鼠肾脏病理情况 （LN，×400倍）

图6 各组大鼠肾脏病理情况 （TGF-β1，×400倍）

图7 各组大鼠肾脏病理情况（TIMP-1，×400倍）

图8 各组大鼠肾脏病理情况（MMP-2，×400倍）

ECM在肾脏的集聚特别是在肾小管间质的增生是导致肾脏组织结构改变的一个标志，它和肾功能下降直接相关［10］。基质金属蛋白酶 （MMPS）在肾脏的主要作用是促进ECM蛋白的降解。它在组织中的活性受到基质金属蛋白酶组织抑制剂（TIMPs）的调控［11］。MMP-2是基质金属蛋白酶家族的一员，具有降解ECM蛋白如胶原、层粘连蛋白和其他细胞外基质的作用［12］。TIMP-1是肾脏MMP-2的特定抑制剂［13］。生理条件下MMPs和TIMPs维持一个动态平衡调控ECM的合成和降解。TGF-β1被认为是在组织纤维化相关疾病发生的一个关键的分子。TGF-β1的重要作用就是通过刺激间质细胞产生各种ECM蛋白。TGF-β1也降低了MMPs的活性并使TIMPs的产生和活性增加。这种作用使成纤维细胞保持和维护它们在持续激活状态下的自分泌机制，导致进一步产生TGF-β1，形成恶性循环导致组织器官纤维化的进展。

芪归益肾方由黄芪、当归和川芎等在一定比例下制成，现代药理学研究发现方剂本身包含多种活性成分。在我们的研究中阿霉素肾病大鼠的尿蛋白和NAG酶随着时间延长而作用增加。而芪归益肾方具有降低尿蛋白和尿NAG酶随时间推移而增加的作用，特别是在8周治疗结束时与模型组比较而言减少超过50%的尿蛋白排泄量 （图1）。治疗效果与西药在大鼠肾小球损伤模型的疗效比较更加显著［14］。进一步数据分析发现，芪归益肾方与贝那普利相比显示出减少尿NAG方面有更好的功效。研究还表明，类似于贝那普利，芪归益肾方减少Col-Ⅰ和LN在肾小球聚集的功效（图4～5）。本研究表明应用芪归益肾方可以有效保护肾脏的结构和功能，且肾功能的保护作用与减少ECM积聚相关（表3）。本研究发现在阿霉素肾病大鼠肾组织TIMP-1的表达增加和MMP-2的表达降低进而增加TIMP-1/MMP-2的比例使基质的降解减少从而导致ECM的聚集 （表3，图7～8）。本药物的肾保护作用与维护MMPs和TIMPs在肾脏表达水平的动态平衡有关，其直接影响ECM在肾脏的聚集［15］。贝那普利能够减少蛋白尿，减少纤维细胞增殖的作用，因而在本研究中作为阳性对照药物。本研究表明芪归益肾方调节MMP-2和TIMP-1在肾组织中的表达水平从而改变了TIMP-1/MMP-2的比例，同时减少TGF-β1在大鼠肾皮质的表达 （表3，图6～8）。

总之，这项研究表明，芪归益肾方抑制肾脏纤维化的机制是多途径作用的结果，其疗效机制与减少尿蛋白漏出、降低尿NAG酶水平以及抑制肾脏ECM积累和改变TGF-β1，TIMP-1和MMP-2在肾脏皮质的表达从而有利于降解细胞外基质有关。本研究提示芪归益肾方可能是一个有前途的预防和治疗肾纤维化的方剂。

致谢：感谢为课题付出辛苦努力的课题组和相关实验室所有的工作人员，特别是苏州大学附属第一医院临床免疫学研究所、苏州大学骨科研究所、苏州大学附属第一医院药学部和苏州大学附属第一医院病理科提供的技术支持。

［1］WeiM G，Sun W，Xiong P H，ed al.Antifibrotic effect of the Chinese herbs Modified Danggui Buxue Decoction on adriamycin-induced nephropathy in rats［J］.Chin J Integr Med，2012，18（8）：591-598.

［2］WeiM G，Xiong PH，Zhang Li.Effectof Chinese herbs on immunoglobulin A nephropathy：a randomized controlled trial［J］，J Trad Chin Med，2013，33（1）：65-69.

［3］Gabbiani G.The biology of themyofibroblast［J］.Kidney Int，1992，41（3）：530-532.

［4］Rysz J，Pedzik A，Markuszewski L，et al.The role ofmetalloproteinases in kidney pathophysiology［J］.Pol Merkur Lekarski 2005，19（114）：812-815.

［5］Ahmed A K，Haylor J L，Nahas A M，et al.Localization of matrix metalloproteinases and their inhibitors in experimental progressive kidney scarring［J］.Kidney Int，2007，71（8）：755-763.

［6］Fogo A B，Kon V.Pathophysiology of progressive renal diseases-an overview，in immunologic renal diseases［M］.2 ed. London：LippincottW illiams&W ilkins.2001：55-72.

［7］Remuzzi G，Bertani T.Pathophysilogy of progressive nephropathies［J］.N Eng1 JMed，1998，339（20）：1448.

［8］Dance N，Price R G，CattellW R，et al.The excretion of N-acetyl-β-glucosaminidase andβ-galactosidase by patientswith renal disease［J］.Clin Chim Acta，1970，27（1）：87-92.

［9］Abbate M，Zoja C，Remuzzi G.How does proteinuria cause progressive renal damage？［J］.JAm Soc Nephrol，2006，17（11）：2974-2984.

［10］Oseto S，Moriyama T，Kawada N，et al.Therapeutic effect of all-transretinoic acid on rats with anti-GBM antibody glomerulonephritis［J］.Kidney Int，2003，64（4）：1241-1252.

［11］Massova I，Kotra L P，Fridman R，et al.Matrixmetalloproteinases：structures，evolution，and diversification［J］.FASEB J，1998，12（12）：1075-1095.

［12］Fu X Y，Park W C，Heineche JW.Activation and silencing of matrixmetalloproteinases［J］.Semin Cell Dev Biol，2007，6（1）：1-12.

［13］Suzuki D，Miyazaki M，Jinde K，et al.In situ hybridization studies ofmatrixmetalloproteinase-3，tissue inhibitorofmetalloproteinase-1 and type IV collagen in diabetic nephropathy［J］. Kidney Int，1997，52（1）：111-119.

［14］Wagner J，Dechow C，Morath C，et al.Retinoic acid reduces glomerular injury in a ratmodel ofglomerular damage［J］.JAm Soc Nephrol，2000，11（8）：1479-1487.

［15］Mangrum A J，Bakris G L.Angiotensin-converting enzyme inhibitors and angiotensin receptor blockers in chronic renal disease：safety issues［J］.Semin Nephrol，2004，24（2）：168-175.

R285.5

B

1001-1528（2015）04-0865-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.039

2014-01-12

国家自然科学基金面上项目 （81273723，81473633）；江苏省中医药管理局资助项目 （LZ13235）；苏州市科学技术局应用基础研究计划 （SYS201016）

魏明刚（1975—），男，副教授，研究方向为肾脏病、免疫病。Tel：13812791993，E-mail：weimg@sina.com