葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及构效分析

马锦锦， 林娟娜， 魏崧丞， 叶开和， 刘清霞， 王小康， 叶春玲

（暨南大学药学院药理学教研室，广东广州510632）

葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用及构效分析

马锦锦， 林娟娜， 魏崧丞， 叶开和， 刘清霞， 王小康， 叶春玲*

（暨南大学药学院药理学教研室，广东广州510632）

目的观察葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶活性的影响，并分析其构效关系。方法以蔗糖作为底物，优化反应条件，建立α-葡萄糖苷酶-蔗糖筛选模型，观察葛根异黄酮类化合物 （0.1、1、10、100μmol/L）对α-葡萄糖苷酶的抑制作用。结果大豆素、刺芒柄花素、大豆苷、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，其中大豆素、刺芒柄花素在100μmol/L时对α-葡萄糖苷酶的抑制作用明显强于阿卡波糖（P＜0.01），其抑制率分别达37.56%和32.11%。3＇-羟基葛根素在0.1μmol/L时的抑制作用较强，但在100μmol/L的作用减弱。经构效分析发现：在大剂量时，异黄酮母核的3位和5位的取代基为羟基且其他位未被取代时，其抑制作用增强；4位取代基为糖氧基，活性将减弱；若为多糖氧基，其活性会更弱；6位为取代基为羟基，在低浓度时有较强的抑制作用，而在高浓度下作用很弱；若6位为甲氧基时，且4位被糖氧基取代时，活性减弱。结论葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶活性具有一定抑制作用，其中大豆素、刺芒柄花素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用较强。

葛根；异黄酮类化合物；α-葡萄糖苷酶；抑制；构效关系

葛根（Pueraria Radix）为豆科植物野葛Pueraria Lobata（wild）Ohwi或甘葛藤Pueraria Thomsonii Benth的干燥根。葛根化学成分中的异黄酮类包括大豆素、大豆苷、3＇-甲氧基葛根素、3＇-羟基葛根素、刺芒柄花素、葛根素等［1］。现代药理学研究表明，异黄酮类化合物具有抗氧化，降血糖，降血脂，保护心肌，扩张冠状血管以及抗血栓等药理作用［2-3］。异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶活性是否有影响，目前均尚未清楚，因此，本实验建立α-葡萄糖苷酶-蔗糖筛选模型，观察葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶活性的影响，并对其进行构效分析。

1 材料

1.1 药物与试剂 葛根异黄酮类化合物大豆素、大豆苷、刺芒柄花素、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-羟基葛根素、大豆苷元-8-C-芹糖 （1→6）葡萄糖、3＇-甲氧基葛根素，均由暨南大学中药与天然药物化学研究所提供。α-葡萄糖苷酶（α-Glucosidase）、DMSO均购自美国Sigma公司，蔗糖（Sucrose）购自广州化学试剂厂，阿卡波糖（Acarbose）购自拜耳医药保健有限公司，无水碳酸钠购自天津市大茂化学试剂厂，PBS购自博士德生物工程有限公司，葡萄糖测定试剂盒购自上海荣盛生物药业有限公司。

1.2 仪器 BL255型电子天平 （北京赛多利斯仪器系统有限公司）；Tecan safire2全波长多功能酶标仪（瑞士Tecan集团）；DK-S22型电热恒温水浴锅 （上海精宏实验设备有限公司）；QL-901型涡旋混合器 （海门市其林贝尔仪器制造有限公司）；96孔细胞培养板 （美国Corning公司）；单道移液器（德国Eppendorf公司）；PHS-3C数字式酸度计（上海雷磁仪器厂）。

2 方法

2.1 葡萄糖的测定 葡萄糖经葡萄糖氧化酶作用生成葡萄糖酸和过氧化氢，后者在过氧化物酶的作用下，将还原性4-氨基安替比林与酚偶联合成可被分光光度计测定的醌类化合物。用0.1 mol/L PBS（pH 6.8）将葡萄糖测定试剂盒中5.55 mmol/L葡萄糖标准液稀释成1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1 mmol/L，分别取不同浓度的葡萄糖溶液50μL，加入150μL葡萄糖工作液，充分混匀，置于37℃水浴15min，于酶标仪为505 nm波长处，以空白调零，检测吸光度 （A），实验重复3次。以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.2 α-葡萄糖苷酶活性反应体系的建立 反应体系总体积为200μL，在70μL PBS（pH 6.8）中加入α-葡萄糖苷酶20μL，37℃预热10 min，加入蔗糖10μL，37℃反应30 min，再加入0.1 mol/L Na2CO3溶液100μL终止反应，取上述反应液50μL，加入150μL葡萄糖工作液充分混匀，于37℃水浴15 min，于505 mm波长检测吸光度 （A）。以不加酶液作为空白对照组，其他组分保持不变，分别改变蔗糖浓度、酶浓度，优化反应体系。确定反应体系后，以阿卡波糖作为阳性药物，观察阿卡波糖在浓度为10～104μmol/L时对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

2.3 葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶活性的测定按 “2.2”项方法优化反应体系，结果为：PBS（pH 6.8）50μL，待测样品20μL，1 U/mLα-葡萄糖苷酶20μL，37℃预热10 min，加入0.8mmol/L蔗糖10μL，37℃反应30 min，再加入Na2CO3溶液100μL终止反应。观察葛根异黄酮类化合物 （终浓度分别为 0.1、1、10、100 μmol/L）对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。实验分组及操作过程见表1，每个浓度做4个复孔，重复3次实验。

表1 α-葡萄糖苷酶活性反应体系

取上述反应液50μL，加入150μL葡萄糖工作液充分混匀，于37℃水浴15 min，于505 min波长检测吸光度（A）。样品对α-葡萄糖苷酶的抑制作用的计算公式：抑制率=（A酶活性对照组-A样品）/（A酶活性对照组-A酶空白组） ×100%。

2.3 统计学处理 采用SPSS 17.0统计软件分析，实验数据以 （）表示。不同浓度葛根异黄酮类化合物与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率进行配对t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 反应体系的建立 按 “2.1”项方法以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制葡萄糖的标准曲线 （y= 0.570 5x+0.000 7，r2=0.999 6），见图1。确定α-葡萄糖苷酶的浓度后发现，当蔗糖的浓度为0.8 mol/L时，OD值到达最高值。因此，选择0.8 mol/L蔗糖作为反应体系的底物浓度，见图2。以0.8mol/L蔗糖作为底物，当酶浓度为1.0 U/mL时，OD值开始到达平台期，葡萄糖生成量也较平缓。因此，选择1.0 U/mL的α-葡萄糖苷酶作为反应体系的酶浓度，见图3。确定蔗糖浓度和酶浓度后，改变阿卡波糖的浓度，结果发现在浓度为10～1×104μmol/L的范围内，阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用呈剂量依赖关系，随着浓度增加，其抑制率逐渐增大，其IC50为623μmol/L，见图4。

3.2 葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶活性的影响

图1 葡萄糖标准曲线

图2 反应体系蔗糖的浓度

葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，阿卡波糖在100μmol/L时的抑制率为15.82%。大豆素、刺芒柄花素、大豆苷、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素对α-葡萄糖苷酶的抑制作用很强，其中大豆素、刺芒柄花素在100μmol/L时对α-葡萄糖苷酶的抑制作用明显强于阿卡波糖 （P＜0.01），其抑制率分别达37.56%和32.11%。而大豆苷、3＇-甲氧基大豆素、葛根素、3＇-甲氧基葛根素在100μmol/L时的抑制作用增强，与阿卡波糖相比无显著性差异（P＞0.05）。3＇-羟基葛根素在0.1μmol/L时的抑制作用较强，但在100μmol/L的作用减弱。详见图5。

图3 反应体系酶浓度

图4 阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶活性的影响

图5 葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶活性的影响

3.3 葛根异黄酮类化合物抑制α-葡萄糖苷酶的构效关系葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶的抑制作用可能存在以下的构效关系。

本次实验发现，在大剂量时，异黄酮母核的3位和5位取代基均为羟基且其它位未被取代时，其抑制作用增强，大豆素比刺芒柄花素或大豆苷的抑制作用更强。若4位取代基为糖氧基，活性将减弱；若为多糖氧基，其活性会更弱，大豆素的抑制作用强于葛根素，而葛根素又强于大豆苷元-8-C-芹糖 （1→6）葡萄糖；若6位取代基为甲氧基时，且4位被糖氧基取代时，活性减弱，3＇-甲氧基大豆素的抑制作用强于3＇-甲氧基葛根素，见表2、图6。

表2 异黄酮类化合物的化学结构

图6 异黄酮的结构式

4 讨论

糖尿病是以高血糖为显著特征的慢性代谢性疾病［4-5］，餐后高血糖是2型糖尿病早期糖代谢异常的指标［6］，因此，降低餐后血糖是防治糖耐量受损 （IGT）、2型糖尿病以及其并发症的重要因素［7-8］。α-葡萄糖苷酶（α-glucosidase）存在于小肠黏膜细胞刷状缘，是食物中绝大部分碳水化合物消化的一种关键酶，将多糖、双糖水解成单糖，然后被机体吸收［9-10］。

α-葡萄糖苷酶抑制剂通过抑制α-葡萄糖苷酶的活性，减少淀粉和蔗糖的水解，延缓糖的吸收，降低餐后血糖和HbA1c水平，进而改善餐后高血糖和高胰岛素血症，这对糖尿病并发症的预防及治疗具有重要的意义［11-12］。一个理想的葡萄糖苷酶抑制剂往往具有以下几个特征：含阳离子、三角形的异头碳中心、并且有一个共价连接的环形成半椅状或椅状构型，以及恰当的羟基构象。因此，带有可以质子化基团的抑制剂可以与酶优先结合，并且这个质子一般是处于环内氧的位置或取代异头碳，或是在糖苷键连接的位点［13-14］。目前上市的 α-葡萄糖苷酶抑制剂具有以上特征，主要有阿卡波糖、伏格列波糖和米格列醇，具有作用温和持久、毒副作用小的优点［15］。

本实验发现，大多数葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，其中大豆素、刺芒柄花素在100 μmol/L的作用较强，甚至强于阿卡波糖。葛根异黄酮类化合物对α-葡萄糖苷酶有不同程度的抑制作用，这可能与葛根异黄酮类化合物的化学结构有关。葛根异黄酮类化合物的基本母核为3-苯基色原酮，经构效分析发现：在大剂量时，异黄酮母核的3位和5位取代基均为羟基且其他位未被取代时，其抑制作用增强；4位取代基为糖基，其活性减弱；若为多糖基，其活性会更弱；6位取代基甲氧基时，且4位被糖氧基取代时，活性减弱。这与良好的葡萄糖苷酶抑制剂所具有的特征有些差别，但大豆素、刺芒柄花素抑制作用较强，有可能成为潜在的葡萄糖苷酶抑制剂，其有待进一步研究。本实验结果也提示，抑制α-葡萄糖苷酶，降低餐后血糖，可能也是葛根异黄酮类化合物的降血糖的作用机制之一。

［1］王治平，李卫民，高 英，等.HPLC同时测定不同产地葛根中6种主要异黄酮类成分的含量［J］.中国实验方剂学杂志，2013，19（8）：125-128.

［2］顾掌生，王大力.葛根素抗糖尿病大鼠心肌线粒体氧化应激损伤作用研究［J］.中华中医药学刊，2010，28（10）：2197-2200.

［3］Promden W，Monthakantirat O，Umehara K，et al.Structure and antioxidant activity relationships of isoflavonoids from Dalbergia parviflora［J］.Molecules，2014，19（2）：2226-2237.

［4］Kim C，Halter JB.Endogenous sex hormones，metabolic syndrome，and diabetes in men and women［J］.Curr Cardiol Rep，2014，16（4）：467.

［5］Samson S L，Garber A J.Metabolic syndrome［J］.Endocrinol Metab Clin North Am，2014，43（1）：1-23.

［6］Dodson C H，Simpson J，Feinstein D.Glycemic control in a medical intensive care setting：revision of an intensive care unit nurse-driven hyperglycemia protocol［J］.Crit Care Nurs Q，2014，37（2）：170-181.

［7］Flint A，Kapitza C，Hindsberger C，et al.The once-daily human glucagon-like peptide-1（GLP-1）analog liraglutide improves postprandial glucose levels in type 2 diabetes patients［J］.Adv Ther，2011，28（3）：213-226.

［8］Yuan L，Guo X，Xiong Z，et al.Self-monitoring of blood glucose in type 2 diabetic patients in China：current status and influential factors［J］.Chin Med J（Engl），2014，127（2）：201-207.

［9］Boath A S，Stewart D，McDougall G J，et al.Berry components inhibitα-glucosidase in vitro：Synergies between acarbose and polyphenols from black currantand rowanberry［J］.Food Chem，2012，135（3）：929-936.

［10］Wang Hui，Du Yang-ji，Song Hua-can.α-Glucosidase andαamylase inhibitory activities of guava leaves［J］.Food Chem，2010，123（1）：6-13.

［11］Pascale R，Carocci A，Catalano A，et al.New N-（phenoxydecyl）phthalimide derivatives displaying potent inhibition activity towardsα-glucosidase［J］.Bioor Med Chem，2010，18（16）：5903-5914.

［12］Zhang Lin，Bai Bing，Liu Xiuhua，et al.α-Glucosidase inhibitors from Chinese Yam（Dioscorea opposita Thunb.）［J］. Food Chem，2011，126（1）：203-206.

［13］Mosi R，Sham H，Uitdehaag JC，et al.Reassessment of acarbose as a transition state analogue inhibitor of cyclodextrin glycosyltransferase†［J］.Biochemistry，1998，37（49）：17192-17198.

［14］Moorthy N S，Ramos M J，Fernandes P A.Fernandes，studies on alpha-glucosidase inhibitors development：magic molecules for the treatment of carbohydrate mediated diseases［J］.Mini Rev Med Chem，2012，12（8）：713-720.

［15］Kamiyama O，Sanae F，Ikeda K，et al.In vitro inhibition ofαglucosidases and glycogen phosphorylase by catechin gallates in green tea［J］.Food Chem，2010，122（4）：1061-1066.

R285.5

B

1001-1528（2015）04-0858-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.037

2014-01-10

广东省高等学校科技创新重点项目 （cxzd1111）

马锦锦（1988—），女，硕士生，研究方向为内分泌药理学。Tel：13719425254，E-mail：majin569@163.com

*通信作者：叶春玲 （1963—），博士，教授，硕士生导师，研究方向为内分泌药理学。Tel：（020）85223843，E-mail：yechunling2005@163.com