绿茶对五倍子发酵品的影响
2015-01-17史莲莲邓德英张振凌崔雅萍
史莲莲， 邓德英， 张振凌， 崔雅萍
（河南中医学院呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南郑州450008）
绿茶对五倍子发酵品的影响
史莲莲， 邓德英， 张振凌*， 崔雅萍
（河南中医学院呼吸疾病诊疗与新药研发河南省协同创新中心，河南郑州450008）
目的比较百药煎 （五倍子发酵品）中鞣质和没食子酸含有量来选择何种绿茶 （茶叶，茶渣和茶汁）作为发酵基质。方法制备茶叶、茶渣和茶汁与五倍子混合发酵产物后，采用紫外分光光度法测定鞣质含有量，高效液相法测定没食子酸含有量。结果五倍子、酒曲与煎煮后的茶渣、茶汁混合发酵的鞣质含有量为11.59%，没食子酸含有量为10.43%；五倍子、酒曲、茶叶直接混合发酵的鞣质含有量为15.25%，没食子酸含有量为6.21%；五倍子、酒曲与煎煮后的茶汁混合发酵的鞣质含有量为16.41%，没食子酸含有量为7.63%；五倍子、酒曲混合发酵的鞣质含有量为21.39%，没食子酸含有量为5.34%。结论茶叶煎煮后茶渣和茶汁一起加入五倍子酒曲中发酵，鞣质转化率最高，发酵效果最好。
五倍子；百药煎；发酵；绿茶；鞣质；没食子酸
传统中药百药煎是由五倍子经发酵制备而成，最早见于 《本草蒙筌》： “五倍子造成，新五倍子十斤，舂捣烂细，磁缸盛，稻草盖合，七昼夜，取出复捣，加桔梗、甘草末各二两，又合一七，仍捣仍合，务过七次，捏成饼锭，晒干任用。如无新鲜，用干倍子水渍为之”［1］，这也是我国较早时期用以制备没食子酸的方法。目前对于百药煎的制备工艺没有规范性标准， 《中药大辞典》［2］等文献资料收载有百药煎炮制方法，原料都是由 “五倍子、茶、酵曲发酵”［3-5］。历代 《中国药典》以及全国中药炮制技术规范中没有收录百药煎，仅 《江西省中药炮制规范》1991年版［6］和 《浙江省中药炮制规范》2005年版［7］收载，且对于绿茶加入方法描述不一。已有文献对发酵过程中酒曲的筛选和发酵工艺［8］进行过报道，但绿茶及其不同加入方式对五倍子发酵的影响尚无研究。本实验通过比较不同加入方式的绿茶发酵五倍子后鞣质和没食子酸的含量变化，探索绿茶对百药煎质量的影响，期望能对传统工艺进行优化，推动传统中药炮制的现代化。
1 仪器与材料
1.1 仪器 高效液相色谱分析仪（岛津LC-2010A HT，日本岛津公司）；KQ-500DV型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；METTLER AE 240型十万分之一电子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；BS 210S电子天平 （北京赛多利斯天平有限公司）；DHG-9076A型电热恒温鼓风干燥箱 （上海精宏实验设备有限公司）；UV-3200S紫外可见分光光度计 （上海美谱达仪器有限公司）；FW-100高速万能粉碎机 （北京中兴伟业仪器有限公司）；SZ-93自动双重纯水蒸馏器 （上海亚荣生化仪器厂）；8002型温控水浴锅 （北京永光明医疗仪器厂）。
1.2 试剂 甲醇 （天津四有精细化学品有限公司，批号140112，一级色谱纯）；双蒸水 （自制）；磷酸 （天津市登科化学试剂有限公司，批号20121107，分析纯）；没食子酸对照品 （中国食品药品检定研究院，批号110831-200803）；磷钼钨酸试剂 （自制）；无水碳酸钠 （北京化工厂，分析纯）；安琪酿酒曲 （湖北宜昌安琪有限公司，批号20130528）；绿茶 （中国农业科学院茶叶专业市场）。
1.3 药材 五倍子购于安徽亳州中药饮片厂，批号20130812，经鉴定为漆树科植物盐肤木Rhus chinensis Mill.等树上寄生倍蚜科昆虫角倍蚜或倍蛋蚜后形成的虫瘿，符合 《中国药典》2010年版“五倍子”项下的各项规定。
2 方法与结果
2.1 样品的制备
2.1.1 五倍子 将五倍子药材洗净，80℃干燥4 h，粉碎，过80目筛。
2.1.2 五倍子、酒曲发酵 取以上五倍子粉末10 g，酒曲3 g，混匀，加水4.5 mL，搅拌均匀，切成小方块，置于表面皿中。
2.1.3 五倍子、酒曲加绿茶发酵 取以上五倍子粉末10 g，酒曲3 g，绿茶粗粉 （过三号筛）1 g，混匀，加水4.8 m L，搅拌均匀，切成小方块，置于表面皿中。
2.1.4 五倍子、酒曲与煎煮后的茶渣、茶汁混合发酵 取以上五倍子粉末10 g，酒曲3 g，混匀备用，另取1 g茶叶粗粉置于30 mL沸水中煎煮15 min，放至室温，过滤，煎煮液茶汁体积为10.2 mL，取4.8 mL茶汁连同茶渣一起加入上述五倍子酒曲粉末中，搅拌均匀，切成小方块，置于表面皿中。
2.1.5 五倍子、酒曲与绿茶煎煮液混合发酵 取以上五倍子粉末10 g，酒曲3 g，混匀备用。另取1 g茶叶粗粉置于30 mL沸水中煎煮15 min，放至室温，滤去茶渣，煎煮液茶汁体积为10.5 mL，取4.8 mL茶汁加入上述五倍子酒曲粉末中，搅拌均匀，切成小方块，置于表面皿中。
将以上制备的样品放入恒温恒湿箱 （温度35℃；相对湿度75%）中发酵48 h，取出，于60℃烘箱中烘10 h，粉碎，过四号筛，备用。
2.2 外观性状 外观性状比较，4种制备方法都具有发酵作用，在发酵48 h时，五倍子、酒曲与煎煮后的茶渣、茶汁混合发酵样品表面已经布满银白色的菌丝，且体积发膨，故从外观性状来看，以五倍子、酒曲与煎煮后的茶渣、茶汁混合发酵效果最好。
2.3 不同发酵品含水量测定 按 《中国药典》2010年版一部附录水分含量测定项下的烘干法，分别取不同发酵品各0.5 g，平铺于干燥至恒定质量的扁形称量瓶中，精密称定，打开瓶盖在105℃烘箱中干燥5 h，将瓶盖盖好，移至干燥器中，冷却30 min，精密称定质量，再在上述温度下干燥1 h，冷却，称定质量，至连续两次称重的差异不超过5 mg为止。根据减失的质量，计算供试品中的含水量。
2.4 五倍子不同发酵品中没食子酸测定
2.4.1 对照品溶液的制备 取没食子酸对照品2.0 mg，精密称定于25 mL量瓶中，用50%甲醇溶解，定容至刻度，得0.08 mg/m L对照品溶液。
2.4.2 供试品溶液的制备 精密称取样品0.1 g，置100 mL锥形瓶中，加入50%甲醇20 mL，浸泡过夜，次日超声提取40 min，提取两次，每次20 m L，过滤，合并滤液，加甲醇定容至100 m L量瓶中，摇匀，用0.45μm即得。
2.4.3 色谱条件 Agilent HC-C18（2）色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相甲醇-0.1%磷酸（10：90）；体积流量0.8 mL/min；检测波长270 nm；柱温30℃。
2.4.4 方法学考察
2.4.4.1 线性关系考察 精密吸取 “2.4.1”项下没食子酸对照品溶液1、2、4、6、8、10μL注入高效液相色谱仪，测定其峰面积。以进样量为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线，结果表明在0.08～0.8μg范围内线性关系良好，回归方程为y=4 287 380.26x+13 110.74，r2=0.999 9。
2.4.4.2 精密度试验 精密吸取“2.4.1”项下没食子酸对照品溶液10μL，注入高效液相色谱仪，重复进样6次，测定其峰面积，计算得RSD为0.8%，仪器精密度良好。
2.4.4.3 稳定性试验 取0.1 g五倍子、酒曲发酵样品，精密称定，按照 “2.4.2”项下供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，分别在0、4、8、12、24 h进样，每次进样量6μL，测得没食子酸峰峰面积，计算得RSD为0.4%，表明样品溶液在24 h内稳定。
2.4.4.4 重复性试验 取0.1 g五倍子、酒曲发酵样品6份，精密称定，按照 “2.4.2”项下供试品溶液的制备方法制得供试品溶液，分别进样6 μL，测定没食子酸峰面积，计算得RSD为2.2%，表明其重复性良好。
2.4.4.5 加样回收率试验 取9份已知没食子酸含有量的五倍子、酒曲发酵样品，精密称定，分别加入没食子酸标准溶液（2.98 mg/mL）1.5、1.5、1.5、1.8、1.8、1.8、2.1、2.1、2.1 m L，按照“2.4.2”项下供试品溶液的制备方法制成供试品溶液，分别进样6μL，测定没食子酸峰峰面积，计算结果见表1。
表1 加样回收率试验Tab.1 Results of recovery tests
2.4.4.6 五倍子不同炮制品中没食子酸测定结果分别精密吸取五倍子不同炮制品的供试液6μL，注入高效液相色谱仪，测定没食子酸峰峰面积，以干燥品计算含量。见表3。
2.5 五倍子不同发酵品鞣质测定
2.5.1 对照品溶液的制备 精密称取没食子酸对照品50 mg，置100 mL棕色量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，精密量取5 mL，置50 mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得 （每1 mL中含没食子酸0.05 mg）。
2.5.2 供试品溶液的配制 精密称取五倍子不同发酵品药材粉末0.2 g置于250 mL棕色量瓶中，加水150 mL，放置过夜，超声处理30 min，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，静置，滤过，弃去初滤液50 mL，精密量取续滤液20mL置100mL棕色量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.5.3 供试品的测定
2.5.3.1 总酚 精密量取供试品溶液2 m L，置25 mL棕色量瓶中，加入磷钼钨酸试液1 mL，加水10 mL，用29%碳酸钠溶液的定容至刻度，放置1 h，依法测定吸光度，从标准曲线中读出供试品溶液中没食子酸的量 （mg），计算，即得。
2.5.3.2 不被吸附的多酚 精密量取供试品溶液25 mL，加至已盛有干酪素0.6 g的100 mL具塞锥形瓶中，密闭，置30℃水浴中保温1 h，时时振摇，取出放冷，摇匀，滤过，弃去初滤液，精密量取续滤液2 mL，置25 mL棕色量瓶中，加磷钼钨酸1 mL，加水10 mL，用29%的碳酸钠溶液定容至刻度，放置1 h，测吸光度值。
2.5.4 方法学考察
2.5.4.1 标准曲线的制备 精密量取对照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL，分别置25 mL棕色量瓶中，各加入磷钼钨酸试液1 mL，分别加水11.5、11、10、9、8、7 mL，用29%碳酸钠溶液稀释至刻度，摇匀，放置60 min以相应的试剂为空白，照紫外可见分光光度法，在760 nm的波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，质量浓度为横坐标，绘制标准曲线。得回归方程：A= 0.092 463C+0.063 4（r2=0.999 5）样品溶液在1～10μg/mL之间呈线性关系。
2.5.4.2 精密度试验 精密吸取对照品溶液1 mL，按 “2.5.3.1”项总酚的定量测定方法，重复测定6次，于760 nm处测定吸光度，结果吸光度的RSD值为1.4%，仪器精密度良好。
2.5.4.3 稳定性试验 精密吸取五倍子、酒曲与煎煮后的茶渣、茶汁混合发酵溶液2 mL，按“2.5.3.1”项照总酚的测定方法，显色1 h后，每隔10min测定一次吸光度，共6次，计算RSD为0.3%，表明五倍子鞣质在显色终止反应后1 h内测结果稳定。
2.5.4.4 重复性试验 取6份五倍子、酒曲与煎煮后的茶渣、茶汁混合发酵粉末0.2 g，精密称定，按照上述供试品的制备方法，制备供试品溶液，进行鞣质测定，结果平均含有量为11.80%，RSD为1.5%，表明该方法重复性良好。
2.5.4.5 加样回收率试验 取6份五倍子、酒曲与煎煮后的茶渣、茶汁混合发酵粉末50 mg，精密称定，分别加入没食子酸（2.95 mg/mL）对照品1.6、1.6、1.6、2.0、2.0、2.0、2.4、2.4、2.4 mL。按照供试品溶液制备方法制备，并按照鞣质测定方法测定，结果平均回收率为99.5%，RSD为0.7%，说明该测定方法测定的结果准确，结果见表2。
表2 加样回收率试验Tab.2 Results of recovery tests
2.5.4.6 计算方法 鞣质含有量=总酚-不被吸附的多酚，结果见3。
表3 五倍子不同发酵品鞣质和没食子酸测定结果Tab.3 Contents of tannins and gallic acid in different fermetation products of chinese gall
3 讨论
本实验结果显示，五倍子、酒曲和煎煮后的茶渣、茶汁混合发酵品与不加茶叶的五倍子、酒曲发酵样品相比，鞣质含有量降低9.8%，没食子酸含有量增加5.09%，表明鞣质分解的最多，其原因可能是茶叶煎煮后蛋白质氨基酸等含有量增高，更有利于发酵菌种的生长，产生的分解酶类能够更加有效的对鞣质进行作用，但具体机理尚需实验证明。
有文献利用电子鼻检测系统监测不同发酵时间的百药煎样品以及发酵过程中气体成分的变化，来确定最佳发酵时间［9］。表观分析来看，百药煎最佳发酵时间为72 h，而前期预实验发现，五倍子发酵72 h时，发酵样品表面已长出大量黑色霉菌，而发酵48 h时，表面布满银白色的白霜，故本实验选取48 h为发酵终止时间。
查阅文献发现［8］，在水和乙醇提取液中，没食子酸的峰形较宽且有肩峰出现，而在甲醇提取液中，没食子酸峰的峰形对称，适合定量，故选取甲醇作为提取溶剂。在提取方法选择方面，采用超声提取法所测得的没食子酸的量明显高于冷浸法和回流提取法，故本实验选取超声提取。
目前百药煎的传统炮制工艺研究方面还不完善［10-11］，尽管五倍子、茶、酵曲用量比例已有研究，但是不同文献中具体的操作方法不一，如何操作才能使发酵效果更好尚有待于深入研究。百药煎现代炮制工艺的制定，菌种的筛选，质量标准的确定，系统的研究其化学成分和药理作用，有无新成分的产生，都是我们下一步的研究方向。
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Effect of green tea on fermented Galla chinensis
SHILian-lian， DENG De-ying， ZHANG Zhen-ling*， CUIYa-ping
（Collaborative Innovation Center for Respiratory Disease Diagnosis and Treatment&Chinese Medicine Development of Henan Province，Henan University of Tradrtional Chinese Medicine，Zhengzhou 450008，China）
Gall chinensis；chinese gall leaven；fermatation；green tea；tannins；gallic acid
R283
A
1001-1528（2015）04-0836-04
10.3969/j.issn.1001-1528.2015.04.032
2014-06-09
六神曲等6种中药发酵技术规范与应用研究—百药煎 （201407009-05）
史莲莲，女，硕士生，研究方向为中药饮片及新药开发。Tel：15837149352，E-mail：15837149352@163.com
*通信作者：张振凌 （1957—），女，教授，博士生导师，研究方向为中药饮片及新药开发。Tel：（0371）65680970，E-mail：zhangzl6758@163.com
