手参奶制工艺

2015-01-17徐晓雪李晓鹏韩伟健林晓彤

中成药 2015年4期

关键词：生品浸出物天麻

徐晓雪，李晓鹏，钟旭，韩伟健，郭娜，林晓彤，许枬

（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

手参奶制工艺

徐晓雪，李晓鹏，钟旭，韩伟健，郭娜，林晓彤，许枬*

（辽宁中医药大学药学院，辽宁大连116600）

目的依据炮制工艺参数优化蒙药手参的奶制工艺。方法采用浸出物测定法测定手参奶制品的浸出物；用HPLC法测定手参制品中的天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine、loroglossin的含有量；通过水迷宫实验考察手参对衰老小鼠学习记忆能力的影响；采用ELISA法检测小鼠脑组织中丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活力。结果综合各因素的影响，手参奶制的最佳炮制工艺为加入手参质量30%的鲜牛奶闷润12 h后，于120℃烘制法6 min。结论优化手参奶制工艺稳定，重复性好，与生品比手参奶制品的抗衰老和抗氧化活性明显增强。

手参；炮制；高效液相色谱；m ilitarine；浸出物

KEY WORDS：Gymnadenia conpsea R.Br.；milk processing；HPLC；militarine；ethanol-soluble extraction

民族药炮制具有鲜明的民族特色和优势，但随着科技的发展，民族药炮制工艺的不规范、不统一，甚至误传误用的现象逐渐暴露出来，严重影响了其继承和创新［1］。蒙药手参Gymnadenia conopsea（L.）R.Br.，为兰科手参属多年生草本植物手参的干燥根茎，具有增力生精、温肾暖肾、大补元气、安神增智等功效［2-3］，用于治疗肾虚、失眠、记忆力减退等病症［4］，由于其良好的抗衰老和抗疲劳作用而备受关注［5］。手参在蒙医临床上常以奶制法炮制［6-7］，以增强其补益作用。目前关于手参奶制工艺研究较少，实际工业生产中工艺粗放，多凭经验操作，缺乏严格工艺参数控制，难以保证饮片质量稳定性和临床有效性。手参的醇浸出物和天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine、loroglossin单体均具有抗氧化和抗衰老活性［8］，且4种成分在手参中含有量较高。因此，本实验以醇浸出物、4种活性成分含有量、抗衰老活性等多种与质量密切相关的参数为指标，系统地考察各炮制工艺参数对手参奶制品质量的影响，优化辅料用量（鲜奶用量）、干燥温度及时间等工艺参数，为手参奶制工艺的规范化生产提供科学数据。

1 仪器与试药

Agilent1100型高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、检测器、工作站）；Sartorius CP225D十万分之一电子天平（德国Sartorius公司）；KQ-250DB数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；Morris水迷宫MS-1（成都仪器厂）；天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine和loroglossin均为本实验室自制（纯度分别为98.3%，97.4%，97.9%，98.7%）；甲醇（色谱纯，美国天地试剂公司）；水为高纯水（自制），其余试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（批号20140313GT）；丙二醛（MDA）试剂盒（批号20140313FV）；NIH小鼠购于大连医科大学，合格证号SCXK（辽）2008-0002；手参饮片购自安国药材市场，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为手参Gymnadenia conpsea R.Br.的干燥根茎。

2 实验方法与结果

2.1 奶制手参的制备参照《中华本草》（蒙药卷）［9］，取手参生品饮片，加入不同体积分数的牛奶，拌匀，室温浸润12 h，按正交实验设计，将润透后的手参在设定的温度下采用烘制法进行干燥，得不同工艺的手参奶制品。

2.2 醇浸出物测定照《中国药典》的醇浸出物测定法（热浸法）［10］，测定手参奶制品的醇浸出物得率。

2.3 活性成分测定

2.3.1 色谱条件考察 Kromasil C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5μm）；流动相为甲醇（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0～10 min，10% ～30%A；10～15 min，30% ～45%A；15～25 min，45% ～85%A）；体积流量1.0 mL/min；检测波长220 nm，柱温25℃。被测成分的色谱峰分离度好，基线平稳，见图1。

图1 手参供试品（A）和对照品（B）HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram s of sam p le（A）and reference substances（B）

2.3.2 对照品溶液的制备精密称取天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine、loroglossin对照品适量，加甲醇制成每1 m L含天麻素0.359 1 mg、4-羟基苯甲醇0.403 8mg、militarine0.657 2mg、loroglossin 1.411 mg的对照品贮备液。精密量取各对照品贮备液5 mL，置25 m L量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

2.3.3 供试品溶液的制备取手参生品（批号130428）及9份奶制手参粉末1 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，称定质量，超声处理（功率250 W，频率45 kHz）30 min，滤过，用75%甲醇20 mL分次洗涤容器和药渣，洗液与滤液合并，回收溶剂至干，残渣加甲醇溶解，转移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 线性范围考察分别精密吸取上述混合对照品溶液2、4、8、12、16、20μL注入液相色谱仪，测定峰面积。以进样量（μg）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），绘制标准曲线。天麻素回归方程为Y=2.128 4×103X+0.965 4，r= 0.999 5，线性范围0.144～1.44μg；4-羟基苯甲醇回归方程为Y=1.591 6×103X-26.504，r= 0.999 7，线性范围为0.162～1.62μg；militarine回归方程为Y=1.4219×103X-6.119 1，r= 0.999 4，线性范围0.263～2.63μg；loroglossin回归方程为Y=1.2672×103X-21.131，r=0.999 8，线性范围0.564～5.64μg。

2.3.5 精密度试验精密吸取混合对照品溶液20 μL，连续进样6次，测定峰面积。计算混合对照品中天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine、loroglossin峰面积的RSD分别为1.2%、0.8%、1.0%、1.3%，表明仪器精密度良好。

2.3.6 稳定性试验按 “2.3.3”项下方法制备手参生品饮片（批号130428）的供试品溶液，分别于样品制备后的0、2、4、8、12、24、48 h进样分析，测定峰面积。结果天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine、loroglossin峰面积的RSD分别为1.5%、1.4%、1.3%、1.6%。说明供试品溶液在48 h内稳定性良好。

2.3.7 重复性试验取手参生品饮片（批号130428）1 g，共6份，按 “2.3.3”项下的方法分别制备供试品溶液，照 “2.3.1”项的色谱条件进样分析，测定天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine、loroglossin峰面积的RSD分别为1.5%、1.3%、0.9%、1.6%。结果表明，本方法重复性较好。

2.3.8 加样回收率试验精密称取已知天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine、loroglossin含有量分别为0.360 mg/g、0.404 mg/g、0.657 mg/g、1.411 mg/g的手参生品饮片（批号130428）粉末0.5 g，共6份，分别精密加入上述含天麻素0.071 8 mg/mL、4-羟基苯甲醇0.080 8 mg/mL、militarine 0.131 4 mg/mL、loroglossin 0.282 2 mg/mL的混合对照品溶液2.5 mL，置于具塞锥形瓶中，按 “2.3.3”项下方法制备供试品溶液，照 “2.3.1”项下色谱条件进行测定，进样量为20μL，结果天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine、loroglossin峰面积的RSD分别为1.2%、1.3%、1.1%、1.5%，见表1。

表1 天麻素、4-羟基苯甲醇、m ilitarine和loroglossin的加样回收率（n=6）Tab.1 Results of recovery tests for four constituents（n= 6）

2.4 正交试验

2.4.1 因素水平设计依据预试验的结果，以牛奶用量、干燥温度、干燥时间为考察因素，每个因素设定三个水平，按照正交试验设计L9（34）进行试验。以浸出物和活性成分天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine和loroglossin的量为考察指标，因素水平见表2。

表2 奶制手参炮制工艺正交试验因素水平Tab.2 Factors and levels in orthogonal design

2.4.2 综合加权评分法评价将手参奶制品的醇浸出物（m1）、天麻素（m2）、4-羟基苯甲醇（m3）、militarine（m4）、loroglossin（m5）的量进行综合评分［10］，即以1个综合指标（overalldesir-ability，OD）进行统计分析，考察炮制工艺参数对手参制品质量的总体影响。因醇浸出物和天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine、loroglossin单体均具有抗氧化和抗衰老活性［6］，因此权重值各为20%。综合评分OD=0.20×m1/mmax1×100+0.20×m2/ mmax2×100+0.20×m3/mmax3×100+0.20×m4/ mmax4×100+0.20×m5/mmax5，正交试验结果见表3，方差分析结果见表4。

表3 正交试验结果Tab.3 Results of orthogonal test

表4 正交试验方差分析Tab.4 Results of analysis of variance

由表4可见，干燥温度与干燥时间对手参制品质量影响显著，鲜牛奶用量对手参制品质量影响较小。考虑节省的原则，最佳工艺确定为 A1B2C2，即手参生品饮片用体积分数30%的牛奶闷润12 h后，取出，于120℃加热干燥6 min。

2.5 抗衰老试验［11-12］取雌性NIH小鼠（普通级，6周龄，体质量20～22 g）120只适应性饲养1周后，随机分为12组（每组10只）：空白组、衰老模型组、手参生品组、手参不同工艺炮制品组（共9组，见表3）。给药组小鼠灌胃给予相应受试药物8 g/kg，衰老模型组和空白组小鼠灌胃等量的生理盐水溶液，连续给药30 d。用水迷宫实验法测定各组小鼠游出迷宫所用的时间（潜伏期）以及全身进入盲端的次数（错误次数）。并测定小鼠脑组织中丙二醛（MDA）水平和超氧化物歧化酶（SOD）活力。结果见表5。

由表5可见，两个显著影响手参奶制品质量的工艺参数（干燥温度和时间）中的B2（120℃）和C2（6 min）系列工艺的手参奶制品分别较B1（80℃）、B3（160℃）和C1（2 min）、C3（10 min）系列工艺的制品抗衰老作用有显著提高（P＜0.05），且B2C2（120℃，6 min）工艺制品的抗衰老作用最佳。由此提示，优化的炮制工艺确实能提高手参奶制品的补益作用，工艺具有合理性。

表5 手参生制品对衰老小鼠各项指标的影响（，n= 10）Tab.5 Results of anti-aging parameters of the processed products of Gymnadenia conopsea（，n=10）

注：与空白对照组比较，#P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05；与生品组比较，*P＜0.05

编号组别潜伏期/ s 错误次数 MDA/（nmol/mg·Pr）SOD/（U/mg·Pr）34.5±2.0 21.4±7.1 5.0±0.5 0.30±0.03 36.5±2.6 2 模型 120.5±13.3#15.4±0.9# 0.38±0.02# 31.7±1.5#3 生品 85.6±7.2△11.8±1.1 0.36±0.03△ 33.5±2.0 4 A1B1C1 77.6±9.7△10.5±1.4 0.36±0.02△ 33.8±1.7 5 A1B2C2 20.5±6.5*△2.3±0.6*△0.30±0.01*△36.8±2.5△6 A1B3C3 62.7±8.4*△8.4±1.1 0.35±0.01△ 34.3±1.8 7 A2B1C2 46.2±7.4*△6.1±1.3 0.33±0.02*△35.0±1.9 8 A2B2C3 34.5±6.8*△2.9±0.7*△0.32±0.01*△36.3±2.1△9 A2B3C1 45.6±7.9*△5.9±1.5 0.33±0.02*△34.9±1.7 10 A3B1C3 81.3±6.9△11.0±1.8 0.36±0.02△ 33.7±1.6 11 A3B2C1 35.0±7.0*△3.1±0.8*△0.32±0.01*△36.5±0.7△12 A3B3C2 53.1±8.2*△7.1±1.8 0.34±0.01*△1 空白

2.6 工艺验证试验以最佳工艺平行制备3批手参奶制品，照 “2.3.3”项和 “2.3.1”项的方法制备供试品溶液，并分别测定其醇浸出物和天麻素、4-羟基苯甲醇、militarine和loroglossin的量（见表6）。结果表明，各被测指标成分的RSD分别为1.6%、2.0%、1.7%、1.9%、1.6%，说明优化出的炮制工艺稳定可行。

表6 炮制工艺验证Tab.6 Results of process validation

3 讨论

奶制是蒙药的特色炮制方法，主要用于补益药物的炮制，目的是增加补益作用。但相关工艺研究鲜有报道，难以实现此炮制方法在实践中的规范化生产。为此，本实验采用多项与质量有关的指标探讨炮制工艺参数对手参奶制品质量的影响，并优化出手参奶制的最佳工艺及参数，为工业生产规范化提供了科学数据。本实验所制定的炮制工艺经证实稳定可行，且药效学实验表明，优化工艺制品的抗衰老和抗氧化活性强于生品（P＜0.05），说明所建立的工艺能够提高制品的补益作用。

现代药理学研究表明，具有补益气血、安神增智功效的中草药多具有良好的抗衰老作用。石建功等［5］对手参的活性研究发现，其醇提取物可明显改善长期脑供血不足，能够显著增强衰老小鼠脑内与清除自由基有关的SOD的活力，抑制衰老引起的脂质过氧化产物MDA水平的增加，且能改善痴呆模型动物的学习记忆能力障碍。因安神增智作用与抗衰老作用有明确的相关性，故本实验选择抗衰老活性评价炮制工艺对其制品质量的影响。

奶制法的工艺流程由闷润工艺和干燥工艺组成，即先用鲜牛奶闷润药材饮片至透，再进行加热干燥。经单因素预试验确定，手参饮片在加入足量牛奶后12 h即可完全润透，故手参奶制工艺考察时未单独设计闷润工艺的考察，而是将闷润时间固定为12 h，综合考察闷润工艺（牛奶用量）和干燥工艺（干燥温度和时间），优选最佳炮制工艺及参数。实验结果表明，炮制温度和时间对手参炮制品的质量影响较大，当炮制温度达到160℃时，醇浸出物、活性成分的量均显著降低，提示手参中的成分在高温条件下不稳定，故炮制过程中应严格控制加热干燥温度。

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M ilk processing of Gymnadenia conpsea R.Br.

XU Xiao-xue， LIXiao-peng， ZHONG Xu， HANWei-jian， GUO Na， LIN Xiao-tong， XU Nan*

（College of Pharmacy，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China）

文献标志码：A

1001-1528（2015）04-0831-05