电喷雾质谱法研究Kras基因启动子区G-四链体的形成与性质

张士伟，李卉卉，周 江，杨小弟

(1.北京大学化学与分子工程学院，北京 100871；2.南京师范大学化学与材料科学学院，江苏 南京 210046)

近年来，关于G-四链体结构与生物学相关性的研究越来越多[1]。在人类端粒[2]和很多癌基因启动子区域[3-4]均含有能够形成G-四链体的潜在富G序列。已有研究表明，G-四链体结构的形成可能对基因的转录表达有影响[5-7]，因此，G-四链体结构已成为众多科学家研究的热点，并有望作为癌症治疗的新型靶点[8]。

在Kras基因启动子区域，有段富含鸟嘌呤G的核酸酶超敏感位点(NHPPE)[9-10]，它对基因的转录具有重大意义。Cogoi等[11]发现，当此序列形成基因G-四链体结构后，核酸酶的活性受到影响，基因启动表达发生了下调的现象，这将影响到P21蛋白的编码与合成，进一步抑制细胞的分裂。Kras基因G-四链体的形成可协助抑制肿瘤细胞增殖，因此，Kras基因G-四链体结构的形成、稳定性以及构象特点的研究也成为肿瘤疾病治疗的新重点。

本工作以原生型Kras基因启动子区序列(KS1)及其4种突变体序列(KS2～KS5)为研究目标，采用电喷雾质谱(ESI-MS)和圆二色谱(CD)法[12-13]研究Kras基因G-四链体的形成与性质，希望为研究G-四链体的结构和生物学功能提供更多信息，同时也为相关抗癌药物的研制提供更广阔的思路和方向。

1 实验部分

1.1 主要仪器与装置

LCQ DECA XP plus电喷雾质谱仪：美国Thermo Finnigan公司产品，配有电喷雾离子源(ESI)、Xcalibur1.2数据处理系统；J-810圆二色谱仪：日本JASCO公司产品；Mastercycler nexus PCR退火及控温仪：德国Eppendorf公司产品；Seven Multi型pH计：梅特勒-托利多上海仪器有限公司产品。

1.2 主要材料与试剂

HPLC纯化的寡核苷酸序列KS1～KS5：由上海生物工程技术有限公司提供，其序列与命名列于表1；DNA储备液用Milli-Q超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)配制，其他实验用水均为去离子水；实验所用CH3OH、NH4OAc、KCl、NaCl均为分析纯。

表1 实验所用DNA序列及命名Table 1 Sequences and abbreviations of DNA used in this study

1.3 样品处理

1.3.1质谱溶液 用25%CH3OH水溶液配制浓度分别为10、25、50、100 mmol/L的NH4OAc溶液，再分别用这些溶液配制浓度为5 μmol/L的DNA样品溶液，静置2 h后，用质谱采样。

1.3.2CD条件 配制2.5 μmol/L的DNA样品溶液，溶液中阳离子(NH4+、Na+和K+)浓度随条件变化而改变。除NH4OAc溶液外，其他阳离子溶液中tris-HCl浓度均为30 mmol/L。将配好的样品静置30 min后，放入PCR仪中，于90 ℃加热5 min，再以0.1 ℃/min缓慢降温至4 ℃。

1.4 实验条件

1.4.1质谱条件 电喷雾离子源，喷雾电压-2.7 kV，毛细管温度130 ℃，N2流速25 个单位，负离子扫描模式，质量扫描范围m/z1 000～2 000，进样速率2 μL/min。

1.4.2圆二色谱条件 扫描范围320～220 nm，吸收池温度20 ℃，扫描速度100 nm/min，每次进样前均采用背景溶液进行基线校准。变温实验采用固定波长温度间隔模式扫描，吸收池温度从20 ℃以2 ℃/min升至95 ℃。所得数据用Origin软件处理，Boltzmann拟合得出Tm值。

2 结果与讨论

2.1 G-四链体结构的形成

5 μmol/L KS1在10、25 mmol/L NH4OAc溶液中(含25%CH3OH)的ESI-MS图示于图1。ESI-MS结果显示，对于稳定时间相同的溶液，KS1链在10 mmol/L NH4OAc溶液中，质谱基峰是m/z1 412.71，经计算，确认其为单链DNA离子([KS1-5H+]5-)的峰，示于图1a；而当NH4OAc浓度增加到25 mmol/L时，质谱图中的[KS1-5H+]5-离子峰消失，出现的是KS1链加合2个NH4+的复合物离子峰m/z1 418.41([KS1+2NH4+-7H+]5-)，示于图1b。这说明，太低浓度的NH4OAc溶液不利于G-四链体结构的形成，而高于25 mmol/L NH4OAc溶液便可诱导KS1序列形成G-四链体结构。为了进一步确定NH4+结合的特异性，逐步增加NH4OAc溶液的浓度，结果发现，在升高NH4OAc浓度时，ESI-MS谱图中基峰的位置保持不变，即仍是G-四链体离子峰[KS1+2NH4+-7H+]5-，并未检测到DNA加合多个NH4+的复合物离子峰。可见，DNA加合NH4+的数目与NH4OAc的浓度无关，这在一定程度上说明NH4+与DNA的相互结合作用并非一般的非特异性吸附，而是一种选择性的特异性结合方式，即NH4+已经嵌入到G-四分体平面层间，形成了稳定的G-四链体结构。根据加合的NH4+个数可判断，KS1链在NH4OAc溶液中形成了三层G-四链体结构[14]。

图1 5 μmol/L KS1在10 mmol/L(a)和25 mmol/L(b) NH4OAc溶液中(含25%CH3OH)的ESI-MS图Fig.1 ESI-MS spectra of 5 μmol/L KS1 in solution of 10 mmol/L (a) and 25 mmol/L (b) NH4OAc with 25% CH3OH

采用CD光谱研究了不同阳离子对G-四链体结构的诱导和影响。根据文献报道[15]，当富G序列形成G-四链体结构时，其溶液的CD光谱将会出现特征吸收峰。若CD谱图中有260 nm的正吸收和240 nm的负吸收，说明形成的G-四链体为平行构象；若CD谱图中有290 nm的正吸收和260 nm的负吸收，则说明形成的G-四链体为反平行构象[15]。2.5 μmol/L的KS1链在NH4OAc、KCl、NaCl溶液中的CD光谱图示于图2。由图2可见，CD谱图在260 nm和 240 nm处均出现明显的正、负吸收峰，说明该阳离子可以促进Kras启动子G-四链体结构的形成；图中特征吸收峰的强度随着阳离子浓度的升高而增大，这说明提高阳离子浓度有利于G-四链体结构的形成。在NH4OAc溶液中，当NH4+浓度从100 mmol/L增加到150 mmol/L时，CD吸收值的变化不太明显，可见NH4OAc浓度在100 mmol/L时，溶液中2.5 μmol/L KS1转化成G-四链体结构的过程已基本达到平衡状态。而在KCl溶液中，CD吸收值随着阳离子浓度的增加而平稳升高。在NaCl溶液中，当NaCl 浓度在25～100 mmol/L范围内，CD吸收值缓慢增加；但当NaCl浓度升高到100～150 mmol/L时，CD吸收值增加幅度变大，这可能是因为高含量Na+条件有利于促进平衡向KS1形成G-四链体结构的方向移动，因此可检测到更强的CD吸收峰。值得一提的是，在K+条件下，CD图在290 nm 处有微弱的正吸收，而在Na+溶液中，290 nm处的正吸收峰消失，伴随着的是240 nm处的负吸收增强，这说明K+可促进KS1形成平行构象为主的混合构象G-四链体，而Na+则诱导KS1形成平行G-四链体结构。

2.2 G碱基突变对G-四链体结构的影响

突变体KS2序列是由KS1序列中从5’端数起的第6个G碱基突变成T碱基得到的。在ESI-MS实验中，KS2序列质谱图的基峰是DNA结合2个NH4+形成的离子峰m/z1 413.45([KS2+2NH4+-7H+]5-)，示于图3a，这表明，在NH4OAc溶液中，KS2序列形成的G-四链体仍是三层结构。KS1序列中的第13个G碱基突变成T碱基后得到KS3链，KS3序列在质谱图中显示的基峰是m/z1 410.52处的DNA加合1个NH4+形成的5电荷复合物离子峰([KS3+NH4+-6H+]5-)，示于图3b，这说明KS3序列G-四链体大部分已转变为两层结构。KS1序列中第18、19个G碱基突变成T碱基得到KS4链，对于突变体KS4链，ESI-MS谱图中的基峰是m/z1 408.97处的DNA加合了2个NH4+的离子峰([KS4+2NH4+-7H+]5-) ，示于图3c，可见，这两个碱基突变后，对KS1链G-四链体的层数影响并不明显。将上述几种位置的碱基同时突变，即第6、13、18、19位的G碱基均突变为T碱基后，得到的序列KS5在质谱图中的基峰是DNA加合1个NH4+的5电荷离子峰([KS5+NH4+-6H+]5-) ，示于图3d。由于KS5序列比KS1序列更加规整，同时排除了KS1序列中非连续鸟嘌呤G参与G-四链体形成的可能，因此，ESI-MS结果符合实验预想，未检测到加合2个NH4+的复合物离子峰。综合比较原生型KS1序列和几种突变体KS2～KS5序列的质谱现象，可以得出，不同位置的碱基突变对G-四链体结构的形成影响各不相同，其中以第13位的G碱基突变对G-四链体结构层数的影响最为明显。

注：1—25 mmol/L；2—50 mmol/L；3—100 mmol/L；4—150 mmol/L图2 2.5 μmol/L KS1链在NH4OAc(a)、KCl(b)、NaCl(c)溶液中的CD光谱图Fig.2 CD spectra of 2.5 μmol/L KS1 in NH4OAc (a), KCl (b) and NaCl (c) solution

图3 5 μmol/L KS2～KS5(a～d)链在25% CH3OH、50 mmol/L NH4OAc溶液中的ESI-MS图Fig.3 ESI-MS spectra of 5 μmol/L KS2-KS5 (a-d) in solution of 25% CH3OH and 50 mmol/L NH4OAc

通过CD光谱研究比较了KS1～KS5序列G-四链体结构的形成构象特点，2.5 μmol/L KS1～KS5链在NH4OAc、KCl、NaCl溶液中的光谱图示于图4。从图4可以看出：突变体KS2及KS3序列形成的G-四链体构象与KS1相近，均是平行构象为主的混合G-四链体结构；不同的是这3个序列在CD吸收强度上存在差异，KS2在260 nm处的正吸收强度与KS1相近，吸收峰发生明显下降的是KS3序列，这可能与ESI-MS谱图分析中KS3序列所形成的G-四链体层数减少有关。

注：1—KS1；2—KS2；3—KS3；4—KS4；5—KS5；图4 2.5 μmol/L KS1～KS5链在NH4OAc(a)、KCl(b)、NaCl(c)溶液中的CD光谱图Fig.4 CD spectra of 2.5 μmol/L KS1-KS5 in solution of NH4OAc (a), KCl (b) and NaCl (c)

KS4和KS5序列在3种阳离子条件下的CD光谱与KS1序列明显不同，特别是KS4序列，尽管ESI-MS实验表明其在NH4OAc溶液中形成的是三层G-四链体结构，但CD谱图却表明此G-四链体的构象已发生了明显变化，具体表现为260 nm处的正吸收消失，而在290 nm处的正吸收出现微弱的增强，这意味着KS4序列G-四链体已部分转变为反平行构象；而KS5序列在这3种阳离子条件下，CD光谱比KS4链在240 nm和290 nm处的正吸收均明显增强，且在260 nm处出现明显的负吸收，这种变化在KCl和NaCl溶液中也表现出一致的趋势，可见，KS5序列形成的构象相对于KS1序列更加偏向反平行G-四链体结构。

图5 KS1～KS5在30 mmol/L KCl、30 mmol/L tris-HCl溶液中的CD升温归一化图Fig.5 Normalized CD melting of KS1-KS5 in solution of 30 mmol/L KCl and 30 mmol/L tris-HCl

采用CD升温法对G-四链体的稳定性进行评估。将所有富G序列(KS1～KS5)分别溶解在30 mmol/L KCl和30 mmol/Ltris-HCl中，使DNA的最终浓度为2.5 μmol/L，将溶液静置30 min后，于95 ℃ PCR仪中加热5 min，然后以0.1 ℃/min降温至4 ℃。随后采用CD光谱固定波长程序升温扫描，将得到的结果归一化后用Origin作图，即得吸收值随温度的变化关系图，示于图5。对S曲线进行Boltzmann拟合，得到的X0值即为反映各序列稳定性的Tm值，列于表2。由表2可见，KS1～KS3序列的Tm值比较接近，均在75 ℃左右，说明这些序列的G-四链体结构稳定性差别不大；而KS4和KS5序列的Tm值相对于KS1序列均降低约15 ℃，可见其形成的G-四链体结构稳定性相对于原生型序列明显降低，这可能是因为原有稳定的平行构象发生了解链，新的反平行构象不够稳定。

表2 KS1～KS5序列的CD升温Tm值Table 2 Tm values of KS1-KS5

综合分析ESI-MS和CD的结果，发现Kras原生型序列KS1可以形成比较稳定的G-四链体结构，突变位点不同对Kras序列G-四链体的影响各不相同。KS2序列所形成的G-四链体层数、构象和稳定性均与KS1序列差别不大，可见KS1序列第6位的G碱基对其G-四链体结构贡献不大；虽然KS3序列形成的G-四链体构象、稳定性与KS1序列差别不大，但其所形成的G-四链体层数与KS1明显不同，说明第13位G碱基对KS1序列G-四链体结构的形成有一定的贡献，有可能动态参与了G-四链体结构的形成；KS4和KS5序列相对于KS1序列所形成的G-四链体变化最明显，不但构象转变为反平行，且稳定性也明显降低，说明KS1序列第18、19位的G碱基参与了G-四链体结构的形成。

Neidle等[17]发现，癌基因C-kit启动子区序列d(AGGGAGGGCGCTGGGAGGAGGG)在K+溶液中可以形成一种特殊结构的G-四链体，示于图6a，序列中并非处于G碱基连续序列位置的G10也参与了G-四分体平面的形成。本研究根据KS2～KS5序列碱基变化特点以及实验规律，分析KS1序列可能形成了多种结构共存的G-四链体，有一种可能是类似于C-kit序列的G-四链体结构，示于6b，序列中的G13、G18和G19均参与了G-四分体平面的形成。

3 结论

本工作利用ESI-MS和CD法验证了Kras启动子区序列KS1的G-四链体形成，结果表明，在阳离子条件下，KS1序列形成的是平行构象为主的混合构象G-四链体。基因突变实验表明，在KS1序列中，第6位G碱基几乎未参与G-四分体平面的形成，而第13、18、19位的G碱基则很有可能参与G-四分体平面的形成，从而形成一种特殊的G-四链体结构。整体看来，突变后的序列形成G-四链体的能力整体比原生型序列弱，这在一定程度上表明，生物体内一部分基因突变后所导致的癌症可能与G-四链体结构的破坏有关。

图6 C-kit序列(a)[17]和KS1序列(b)可能形成的G-四链体结构图Fig.6 NMR structure of C-kit G-quadruplex (a)[17] and possible structure of KS1 G-quadruplex (b)

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