榅桲总黄酮对血栓形成和血小板聚集作用的影响

轻曼古丽·阿吉， 马 虎， 美合热阿依·伊萨克， 周文婷， 依丽孜拉·阿不都沙拉木，

古丽迪亚尔·伊斯坎代尔1， 艾尼瓦尔·吾买尔1*

（1.新疆医科大学基础医学院药理教研室，新疆乌鲁木齐830011；2.博州人民医院药剂科，新疆 博乐市833400）

榅桲总黄酮对血栓形成和血小板聚集作用的影响

轻曼古丽·阿吉1，2， 马 虎1， 美合热阿依·伊萨克1， 周文婷1， 依丽孜拉·阿不都沙拉木1，

古丽迪亚尔·伊斯坎代尔1， 艾尼瓦尔·吾买尔1*

（1.新疆医科大学基础医学院药理教研室，新疆乌鲁木齐830011；2.博州人民医院药剂科，新疆 博乐市833400）

目的研究榅桲总黄酮对大鼠血栓形成及血小板聚集功能的影响。方法采用胶原蛋白-肾上腺素混合物诱导小鼠肺血栓模型、大鼠动-静脉旁路血栓形成模型、体外对凝血酶诱导的兔血小板聚集作用的影响，观察榅桲总黄酮的抗血栓形成作用。结果榅桲总黄酮能明显提高胶原蛋白-肾上腺素混合物诱导小鼠的存活率；榅桲总黄酮能明显减轻动-静脉旁路血栓湿质量，降低血浆中血栓素B2（TXB2）的水平和增加血浆中6-酮前列腺素F1α（6-keto-PGF1α）的水平；可抑制不同时间点由凝血酶诱导剂诱导的家兔血小板聚集。结论榅桲总黄酮有抗血栓形成作用，并具有抗凝血酶诱导血小板聚集作用。

榅桲总黄酮；血小板聚集；动-静脉旁路血栓模型；血栓素B2；6-酮前列腺素-F1α

榅桲为蔷薇科榅桲属植物榅桲Cydonia oblonga Mill.的成熟果实。榅桲呈梨形，外皮黄棕色或暗红色，皱缩不平，肉厚而粗，切面呈小颗粒状，边缘不卷曲。气芳香，味酸甜［1］。其成熟果实可补脑益心，增益精神力，助胃利水，止渴止咳，用于头晕心慌，神疲乏力，食少胃弱，泻痢咳喘，咯血呕恶，口渴尿闭。

目前对榅桲的化学成分研究较多见，而药理作用只见榅桲提取物具有明显的抑制动脉血栓形成，抗凝血和纤溶作用［2］和降血压、调血脂［3］方面的研究。本实验在前期研究的基础上，进一步研究榅桲总黄酮抗血栓形成作用。

1 材料

1.1 榅桲果实总黄酮和榅桲叶总黄酮制备［4］榅桲果实和叶采自新疆叶城县，置于阴凉通风干燥处干燥，榅桲由新疆医科大学药学院天然药物学/生药学教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为蔷薇科榅桲属植物Cydonia oblonga Mill.的叶和果实。被粉碎成粉末后，用30倍60%乙醇在60℃超声提取3次，每次40 min，合并滤液，用旋转蒸发仪回收乙醇得到榅桲总黄酮浸膏备用。榅桲总黄酮浸膏用大孔树脂进一步富集纯化，得到榅桲总黄酮，按芦丁计算榅桲总黄酮含有量均大于60%。

1.2 动物 小白鼠，雌雄各半，128只，体质量18～22 g，清洁级；均由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（新）2011-0004；SD大鼠，雌雄各半，64只，体质量300～350 g，清洁级；均由新疆医科大学实验动物中心提供，许可证号SCXK（新）2011-0004。

1.3 试剂 阿司匹林（Sigma-Aldrich Chimie Sarl公司，批号081M0194V），乌拉坦 （上海三浦化工有限公司，批号20060418），血栓素B2放射免疫分析药盒 （北京北方生物研究所，批号130620），6-酮-前列腺素放射免疫分析药盒（北京北方生物研究所，批号130620），凝血酶 Sigma-Aldrich公司产品。

1.4 仪器 490-4D型血小板聚集仪（美国CHRONO-LOG公司），BC-2300准全自动三分群血液细胞分析仪 （深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司），GC-2016γ放射免疫计数器 （安徽中科中佳科学仪器有限公司），RE-52AA旋转蒸发仪 （上海亚荣生化仪器厂），SH8210HP超声仪 （上海科导仪器厂），BL1500电子天平 （北京赛多利斯仪器系统有限公司），TDL-5A离心机 （上海菲恰尔分析仪器有限公司），分析天平 （梅特勒托利多仪器厂）。

2 实验方法

2.1 榅桲总黄酮对凝血酶诱导的家兔血小板聚集的影响

2.1.1 富血小板血浆（platelet rich plasma，PRP）和贫血小板血浆（platelet poor plasma，PPP）的制备［5-6］自清醒家兔颈动脉取血，以3.8%枸橼酸钠 （9∶1）抗凝收集于离心管中，在室温条件下，1 000 r/min离心10 min，上层液即为PRP。剩余血液再以3 000 r/min离心15 min，上层液即为PPP，作为测定时调零或用于调整PRP中的血小板数。PRP呈乳白色，PPP呈清亮透明的淡黄色。本实验血小板数控制在2.0×1011个/L（做预实验得到的）。

2.1.2 血小板聚集性测定 按Born氏比浊法原理采用血小板聚集仪进行测定。分别取PPP及PRP各270μL于比浊管中，置于预热孔；于PRP管中加溶媒或药液30μL，37℃恒温温育5 min。测定时用PPP管调幅至100%，再用PRP管调零；如此反复数次至稳定。然后在磁棒搅拌下在PRP中加入诱导剂，凝血酶 （10 U/mL），并记录血小板聚集率。

2.2 榅桲总黄酮对胶原蛋白-肾上腺素诱导小鼠肺血栓形成的影响 小鼠128只，体质量18～23 g，雌雄各半，随机分8组，分为生理盐水对照组，榅桲叶总黄酮小、中、高剂量组 （60、120、240 mg/kg）组，榅桲果实总黄酮小、中、高剂量组 （60、120、240 mg/kg）组，阿司匹林组（15 mg/kg），连续灌胃给药14 d，参照文献［7］的试验方法，称取胶原蛋白30 mg，用生理盐水浸泡2 h以上，另取浓度为1 mg/2 mL的盐酸肾上腺素2 mL加入上述溶液中，混匀，加生理盐水至25 mL即可。于末次给药后30 min尾静脉注射胶原蛋白-肾上腺素混合诱导剂0.1 mL/10 g，造成小鼠体内肺血栓模型。观察注射诱导剂后15 m in内死亡数和存活数。计算药物对小鼠存活率。

2.3 榅桲提取物对大鼠动-静脉旁路血栓形成的影响 取SD大鼠64只，雌雄各半，体质量250～300 g，随机分为8个组：生理盐水对照组，榅桲叶总黄酮小、中、大剂量（40、80、160mg/kg）组，榅桲果实总黄酮小、中、大剂量 （40、80、160 mg/kg）组，阳性对照组阿司匹林 （10 mg/kg）连续给药14 d。末次给药1 h后腹腔注射20﹪乌拉坦0.5 mL/100 g，将麻醉大鼠，参考文献［8-10］方法，在无菌条件下，将大鼠仰卧位固定于动物手术台上，颈部剪毛，常规消毒，铺巾后沿颈前正中线做长约3 cm切口，分离左总颈动脉和右颈总静脉。以聚乙烯管作动-静脉搭桥（动-静脉搭桥由4部分组成：动脉端8cm，内径0.9mm，静脉端8cm内径0.9 mm中间接头段6 cm，内径1.5 mm，中段放入一根长5cm精密称质量的棉线）。以肝素生理盐水溶液 （50 U/m l）湿润聚乙烯管的动脉端。聚乙烯管的静脉端充满生理盐水，用动脉夹夹住动静脉远心端，将聚乙烯管插入已分离出的右颈外静脉，然后再将聚乙烯管的另一端插入左颈总动脉，结扎固定后打开动脉夹，血液从左颈动脉经聚乙烯管流入右颈外静脉。开放血流15 min后迅速取出丝线称质量，总质量减去丝线质量即得血栓湿质量，将榅桲总黄酮小、中、大剂量组与对照组进行比较，求p值和血栓抑制率。

血栓抑制率=（生理盐水组血栓质量-给药组血栓质量）/生理盐水组血栓质量×100%

2.4 榅桲总黄酮对大鼠血栓素TXB2和6-keto-PGF1a的影响

SD大鼠，雌雄各半，64只，体质量250～300 g，动物分组，给药，麻醉及手术方法同 “2.3”项在无菌条件下，造模15 m in后，快速分离腹主动脉，采血EDTA抗凝管1管，颠倒混匀，离心3 500 r/min，15 min，分离血浆，采用放射免疫法检测大鼠血浆中的6-酮前列腺素（6-keto-PGF1α）、血栓素B2（TXB2）。具体操作步骤按照TXB2和6-keto-PGF1α放射免疫试剂盒说明进行。用γ-放射免疫计数仪计数后，根据标准管数据求出直线回归方程，计算出各样本管TXB2和6-keto-PGF1α的量。

2.5 统计学处理 计量资料数据以x±s表示。采用Levene's test检验数据的方差齐性，方差齐则采用One-way ANOVA（单因素方差分析）法进行多组间比较，若多组间比较有显著性差异，则采用LSD检验进行组间两两比较。方差不齐则采用Tamhane's T2检验，P＜0.05为有统计学意义；百分率的比较用χ2检验。试验结果数据采用spss 16.0统计软件包处理。

3 结果

3.1 榅桲总黄酮对凝血酶诱导的家兔血小板聚集的影响

结果显示，榅桲 （叶和果实）总黄酮与血小板作用时间短的时候 （15 min），给药剂量与聚集率成反比关系；作用时间延长的时候 （30 min和45 min），量效关系不明显。作用机制待进一步深入研究。见表1。

表1 体外榅桲叶与果实黄酮对凝血酶 (1 U/m L)诱导血小板聚集的影响

3.2 榅桲黄总酮对胶原蛋白-肾上腺素诱导小鼠肺血栓形成的影响 实验结果提示，与空白对照组比较，榅桲总黄酮各剂量组提高小鼠存活率，有显著性差异 （P＜0.01）。榅桲高剂量组与阿司匹林组差异不显著。可知榅桲总黄酮对胶原蛋白-肾上腺素混合诱导小鼠肺血栓有一定的保护作用。见表2。

表2 榅桲黄酮对胶原蛋白-肾上腺素混合诱导小鼠肺血栓形成的影响 (x±s,n=16)

3.3 榅桲提取物对大鼠动静脉旁路血栓质量的影响 与空白组比较，阿司匹林组、榅桲叶总黄酮中、高剂量组和榅桲果实总黄酮各剂量组都能降低血栓湿质量 （P＜0.01）。榅桲叶总黄酮高剂量组和榅桲果实总黄酮中、高剂量组降低血栓湿质量的作用比阿司匹林组明显。见表3。

3.4 榅桲黄酮对大鼠血栓素B2和6-keto-PGF1α的影响 与空白对照组比较，榅桲叶总黄酮各剂量和榅桲果实总黄酮中、高剂量可显著降低TXB2水平 （P＜0.05或P＜0.01）。榅桲总黄酮 （果实和叶）中、高剂量组可显著升高6-keto-PGF1α水平。榅桲叶总黄酮中、高剂量组和榅桲果实总黄酮高剂量组TXB2/6-keto-PGF1α比值也明显降低（P＜0.05）。与阿司匹林组比较，榅桲叶总黄酮中、高剂量组和果实高剂量组有显著差异 （P＜0.05）。见表4。

表3 榅桲总黄酮对大鼠动-静脉旁路血栓形成的抑制作用(x±s,n=8)

表4 榅桲总黄酮对大鼠血浆中TXB2和6-keto-PGF1α的影响(x±s)

4 讨论

由血栓引起的心血管疾病是影响人类健康的主要原因之一，血栓形成的发病机理中血小板发挥重要作用。血小板和血管壁之间的相互作用是血栓形成和心血管疾病如心肌梗死、中风和动脉粥样硬化的发展的重要因素。一旦血管受损，血小板聚集迅速发生。这些血栓是动脉硬化，心脏发作，中风和周围血管疾病的血栓栓塞并发症的来源［11］。

体外血小板聚集功能的测定是反映血小板在诱导剂作用下发生聚集变化的动态过程，是一种定量检测。榅桲（叶和果实）总黄酮与血小板作用时间短的时候 （15 min），给药浓度与聚集率成反比关系，叶子抑制聚集率作用明显；作用时间延长的时候 （30min和45min），量效关系不明显，可能血小板功能降低有关。作用机制待进一步深入研究。

本实验中，胶原蛋白与肾上腺素均是血小板聚集诱导剂，当两者合用时有显著的协同作用，给小鼠尾部静脉注射以后可诱发小鼠的血栓性偏瘫和死亡。此模型引起的血栓与血小板的活化、黏附、释放及再聚集有密切关系。可知，榅桲总黄酮对胶原蛋白和肾上腺素诱导的肺血栓有一定的保护作用，提高小鼠存活率，可能通过抑制血小板功能来达到抗血栓作用的。

动-静脉旁路血栓模型反映整体动脉血流中血小板的黏附、聚集功能，形成的血栓结构类似动脉中的白色血栓，故与生理、病理情况比较接近［12］。实验结果显示，榅桲叶总黄酮中、高剂量组和榅桲果实总黄酮各剂量组都能降低血栓湿质量 （P＜0.01）。榅桲叶高剂量组和果实中、高剂量组优于阿司匹林组。表明榅桲总黄酮对血小板黏附、聚集所形成的血栓具有一定的抑制作用。

维持血浆TXA2和PGI2水平的相对平衡，对预防血栓及动脉粥样硬化具有重要意义。TXA2与PGI2在血浆中不稳定，可自发水解为稳定代谢产物TXB2及6-Keto-PGF1α测定血浆TXB2及6-Keto-PGF1α水平可反映TXA2及PGI2的合成量［13-14］。PGI2与TXA2的比值对于心血管系统生理功能的稳定与调节至关重要。本实验证实，榅桲总黄酮可升高6-Keto-PGF1α水平及降低TXB2的水平，抗血栓作用可能与此有关。

通过不同的血栓模型考察榅桲不同部位总黄酮的抗血栓形成作用研究可知，榅桲叶总黄酮抗血栓形成作用比较明显，可以考虑将榅桲叶作为今后重点研究药用部位。

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R285.5

：B

：1001-1528（2015）07-1589-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.045

2014-04-15

国家自然科学基金项目 （81260490）

轻曼古丽·阿吉（1984—），女，硕士，从事心血管药理学研究。Tel：18609096153，E-mail：2461469160@qq.com

*通信作者：艾尼瓦尔·吾买尔（1962—），男，教授，博士生导师，从事心血管药理学研究。Tel：（0991）4365602，E-mail：anwar. umar@126.com