HPLC法同时测定不同产地凤尾草中的3种活性成分

刘建群， 刘 健， 蒋 伟， 钟国跃*

（1.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌330004；2.江西中医药大学中药资源与民族药研究中心，江西南昌330004）

HPLC法同时测定不同产地凤尾草中的3种活性成分

刘建群1， 刘 健1， 蒋 伟2， 钟国跃2*

（1.江西中医药大学现代中药制剂教育部重点实验室，江西南昌330004；2.江西中医药大学中药资源与民族药研究中心，江西南昌330004）

目的建立高效液相色谱法同时测定不同产地凤尾草中的蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆树苷3种活性成分的含有量。方法凤尾草甲醇提取液分析采用Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；流动相为乙腈-0.15%甲酸水溶液，梯度洗脱；体积流量1.0mL/min；检测波长258 nm和350 nm；柱温30℃。结果蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆树苷3种活性成分分别在0.025 0～1.60、0.054 0～3.45和0.238～15.2μg的测定范围内表现出良好的线性关系（r＞0.999），加样回收率分别为101.0%（RSD 1.4%）、101.0%（RSD 1.8%）和101.6%（RSD 1.2%）。10个不同来源凤尾草中的蕨素C-3-O-葡萄糖苷最高与最低含有量相差约15倍，忍冬苷含有量相差约8倍，而野漆树苷含有量相差达25倍。结论该方法能同时测定凤尾草中3种活性成分的含有量，而且其药材质量与产地关系较大。

HPLC法；凤尾草；蕨素C-3-O-葡萄糖苷；忍冬苷；野漆树苷

凤尾草为凤尾蕨科植物凤尾草Pterismultifida Poir.的全草或根部，具有清热解毒、凉血止血、消肿解毒等功效，在民间被用于治疗肝炎、菌痢、淋浊、便血、扁桃体炎、痈肿疮毒、湿疹等疾病［1］。《中国药典》1977年版关于凤尾草的功能与主治为清湿热解毒、止血，用于治疗痢疾、黄疸、肝炎、胃肠炎、乳腺炎、白带、崩漏，外治外伤出血、烧伤、烫伤。另外，中药部颁标准第5册还收载了含凤尾草的复方制剂尿感宁冲剂（标准编号WS3-B-0949-91）。研究表明［2-5］，凤尾草中主要含有黄酮类、萜类、甾醇类、挥发油、苯丙素类等成分，具有广谱抗菌、抗肿瘤、抗病毒作用。笔者先前已从中分离鉴定出多个蕨素和黄酮类成分，如蕨素C 3-O-β-D-葡萄糖苷、黄酮类成分野漆树苷和忍冬苷等［6-7］。其中，蕨素类化合物具有显著的生理活性，如保肝、抗氧化、抗癌、促进肠吸收、抗痉挛等［8-11］；忍冬苷具有理想的保肝和治疗肝炎作用，以及抗菌、抗氧化、抗骨质疏松、抗焦虑和抗炎等生物活性；野漆树苷也有保肝、抗氧化、降血压和心率、抑制神经氨酸酶和抗流感等生物活性［7，12-13］。但是，《中国药典》1977年版和卫生部部颁标准关于凤尾草只有形态和显微鉴别，为提高其质量控制水平，建立和完善相关质量标准，本实验采用HPLC法同时测定了多个产地凤尾草中的蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆树苷3种有效成分的含有量，以期为该药材质量评价和标准制定奠定基础。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂和材料 Agilent1200高效液相色谱仪，包括四元泵、柱温箱、VWD检测器和Agilent 1200色谱工作站（美国Agilent Technologies公司）；Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm，迪马科技有限公司）；BS224S、BT25S电子天平 （精度分别为万分之一和十万分之一，德国Sartorius公司）；三氯甲烷、乙酸为分析纯 （西陇化工股份有限公司）；甲醇、甲酸为分析纯 （国药集团化学试剂有限公司）；乙腈为色谱纯 （美国ACS公司）；双蒸水 （自制）。蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆树苷对照品 （自制，纯度均≥98%）。凤尾草药材10批 （购自重庆、四川、北京、江西等地），经江西中医药大学中药资源与民族药研究中心钟国跃教授鉴定为凤尾蕨科植物凤尾草Pterismultifida Poir.的全草或根部。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件 Diamonsil C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5μm）；乙腈-0.15%甲酸水溶液为流动相，梯度洗脱 （0～5 min，5∶95～10∶90；5～10 min，10∶90～15∶85；10～20 min，15∶85；20～25 min，15∶85～25∶75；25～35 min，25∶75）；体积流量1.0 mL/min；检测波长258（0～26 min）、350 nm（26～35 min）；柱温30℃；进样量10μL。混合对照品和凤尾草样品色谱图见图1。

图1 凤尾草样品(A)和混合对照品(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC ch romatogram s of the Pteris multifida sample(A)and reference substances(B)

1.2.2 溶液配制

1.2.2.1 混合对照品溶液的制备 精密称取蕨素C-3-O-葡萄糖苷1.60 mg、忍冬苷3.45 mg和野漆树苷对照品15.20 mg，置于10 m L量瓶中，甲醇溶解，定容，即得质量浓度分别为0.160、0.345和1.520 mg/mL的混合对照品溶液。

1.2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取凤尾草药材粉末1 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加甲醇20 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷后用甲醇补足减少的质量，0.45μm微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2 结果

2.1 线性关系考察 精密吸取 “1.2.2.1”项下混合对照品溶液，分别稀释0、2、8、16、64倍，进样10μL，在 “1.2.1”项色谱条件下测定。然后，以峰面积值为纵坐标，对照品量 （μg）为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程与线性范围，见表1。由表可知，该方法呈良好的线性关系（r＞0.999）。

表1 回归方程与线性范围Tab.1 Regression equations and linear ranges

2.2 重复性试验 精密称取5份产自重庆龙池镇的凤尾草药材各1 g，按 “1.2.2.2”项下方法操作，测定样品中蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆树苷的峰面积。结果，这3个成分的RSD（n= 5）分别为1.9%、1.5%、0.8%，说明该方法重复性良好。

2.3 精密度试验 精密吸取混合对照品溶液 （蕨素C-3-O-葡萄糖苷0.160 mg/mL、忍冬苷0.345 mg/mL、野漆树苷1.520 mg/mL）10μL，重复进样5次，记录峰面积。结果，样品中这3个成分的RSD（n=5）分别为1.4%、1.6%、1.8%，说明仪器精密度良好。

2.4 稳定性试验 精密称取5份产自重庆龙池镇的凤尾草药材各1 g，按 “1.2.2.2”项下方法操作，室温放置 0、2、4、6、8、12、24 h后在“1.2.1”项色谱条件下测定。结果，样品中蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆树苷的RSD（n= 7）分别为0.1%、0.7%、1.0%，说明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5 加样回收率试验 精密称取含有量已知的产自重庆龙池镇的凤尾草样品0.5 g，共6份，然后精密吸取对照品溶液（蕨素C-3-O-葡萄糖苷3.2 mg/mL、忍冬苷6.9 mg/mL和野漆树苷17.5 mg/mL）各0.1 mL，加入药材中，按“1.2.2.2”和“1.2.1”项下方法操作 （用甲醇19.7 mL提取）和测定，计算3种化合物的加样回收率。结果，蕨素C-3-O-葡萄糖苷、忍冬苷和野漆树苷的加样回收率分别为99.9%～103.5%（RSD 1.4%）、99.2%～104.1%（RSD 1.8%）、99.5%～103.0%（RSD 1.2%），说明该方法的加样回收率良好，见表2。

2.6 样品测定 不同产地样品按 “1.2.2.2”项下方法操作，在 “1.2.1”项色谱条件下测定，每个产地样品平行测定3次，取峰面积平均值，按标准曲线计算，结果见表3。

表2 加样回收率试验结果Tab.2 Results of recovery tests

3 讨论

蕨素C-3-O-葡萄糖苷为1-茚酮的糖苷衍生物（结构见图2），紫外光谱显示，其有3个吸收峰，λmax1、λmax2和λmax3分别为 303、258和217.5 nm，ε1、ε2和ε3分别为3.6×103、2.6×104和5.4× 104L/（mol/cm），而且野漆树苷和忍冬苷在350 nm处均有吸收峰。综合灵敏度和干扰方面，本实验选择在258 nm波长下测定蕨素C-3-O-葡萄糖苷，而在350 nm波长下测定野漆树苷和忍冬苷。根据表3可知，不同产地凤尾草中野漆树苷和忍冬苷的含有量较高，而蕨素C-3-O-葡萄糖苷的含有量相对较低。此外，各产地凤尾草中蕨素C-3-O-葡萄糖苷的含有量在0.09～1.35 mg/g之间，其中重庆巫溪和龙池镇样品中的含有量较高，而北碚样品中未测得该成分；忍冬苷的含有量在0.95～7.56 mg/g之间，其中重庆开县样品中的含有量较高；野漆树苷的含有量在0.22～5.48 mg/g之间，其中重庆开县、巫溪和万州样品中的含有量较高。综上所述，不同产地凤尾草中3种有效成分的含有量差异较大，其中蕨素C-3-O-葡萄糖苷最高与最低含有量相差约15倍，忍冬苷含有量相差约8倍，而野漆树苷含有量相差达25倍，提示凤尾草药材质量与产地关系较大。

表3 样品测定结果Tab.3 Content determ ination of sam p les from different grow ing areas(mg/g,n=3)

图2 蕨素C-3-0-葡萄糖苷结构Fig.2 Structrue of p terosin C 3-0-β-D-glucosidede

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Sim ultaneous determ ination of three constituents in Pterismultifida from different grow ing areas by HPLC

LIU Jian-qun1， LIU Jian1， JIANGWei2， ZHONG Guo-yue2*
（1.Jiangxi University of Traditional Chinese Medicine；Key Laboratory of Modern Preparation of Traditional Chinese Medicine，Ministry of Fducation，Nanchang 330004，China；2.JiangxiUniversity of TraditionalChineseMedicine；TheChineseMedicineResourceand NationalMedicine Research Center，Nanchang 330004，China）

AIMTo establish an HPLCmethod for simultaneously determining three constituents（pterosin C 3-O-β-D-glucosidede，lonicerin and rhoifolin）in Pterismultifida from different growing areas.METHODSThe P.multifida methanol extractwas carried out on a Diamonsil C18Column（4.6 mm×250 mm，5μm），themobile phase was acetonitrile-water（containing 0.15%formic acid）in a gradient elution manner，the flow rate was 1.0 mL/min at30℃，and the detection wavelength was setat258 nm and 350 nm，respectively.RESULTSExcellent chromatographic separation was achieved with good linearity（r＞0.999）within the studied concerntration ranges.The recovery ranges for pterosin C 3-O-β-D-glucosidede，lonicerin and rhoifolin were 101.0%（RSD 1.4%），101.0%（RSD 1.8%），and 101.6%（RSD 1.2%），respectively.The difference of pterosin C 3-O-β-D-glucosidede content in P.multifida collected from 10 growing areas between maximum and minimum value reached 15 times，of lonicerin about 8 times，and of rhoifolin as high as25 times.CONCLUSIONThemethod can simultaneously determine the 3 constituents in P.multifida，and the growing areas of this plant are closely linked to its quality.

HPLC；Pterismultifida；pterosin C 3-O-β-D-glucosidede；lonicerin；rhoifolin

R284.1

：A

：1001-1528（2015）07-1518-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2015.07.026

2014-10-09

中药国家药品标准提高暨2015版药典科研项目；国家自然科学基金资助项目 （30960495）

刘建群 （1970—），男，博士，教授，从事中药活性成分及质量评价研究。Tel：（0791）87119027，E-mail：liu5308@ sina.com

*通信作者：钟国跃 （1958—），男，博士，研究员，从事中药资源、质量评价与民族药研究。E-mail：zgy1037@163.com