紫云英根瘤菌不同菌株间结瘤竞争能力的比较

2015-01-15郑会明翟娜娜毛怡玲钟增涛

江苏农业科学 2014年11期

郑会明+翟娜娜+毛怡玲+钟增涛

摘要：通过竞争结瘤试验研究紫云英根瘤菌不同菌株间的竞争结瘤能力，以紫云英宁波大桥品系为宿主植物，7株分离自不同生境紫云英根部瘤体内的菌株与中慢生华癸根瘤菌7653R为研究对象，采用单独接种、与7653R菌株1∶1混合接种方式，在30d时采样，统计根瘤数量、根瘤质量、不同菌株的占瘤率、定殖能力等。结果发现，紫云英根瘤菌2号菌株的竞争能力与7653R相当，其他菌株的竞争性都不同程度地弱于7653R，尤其是1号菌株的定殖能力最弱，仅是7653R占瘤率的9%。在同时含有2种根瘤菌的瘤体内，7653R和竞争菌株的数量比例相近。不同生境根瘤菌的竞争结瘤能力存在差异，试验同时获得了1株与经典菌株7653R竞争能力相当的紫云英根瘤菌菌株。

关键词：紫云英根瘤菌；7653R；竞争性；占瘤率

中图分类号：S182文献标志码：A 文章编号：1002-1302（2014）11-0403-03

豆科植物的固氮作用是在根瘤菌的参与下完成的，其过程包括根瘤菌吸附侵染豆科植物根毛，引起根毛卷曲形成侵入线，最终引起植物形成根瘤，根瘤菌在根瘤内部进行生物固氮并将其产物输送给植物。该共生固氮体系在促进农业可持续发展、减少化学氮肥施用、保护生态环境等方面都具有极其重要的意义，因而研究、开发、利用这一共生固氮体系具有重大的生态、经济和社会价值[1]。大豆、豌豆、苜蓿、三叶草、菜豆等豆科植物可以作为动物以及人类的食物氮源；紫云英可作为田间作物的氮肥提高作物产量，也可作为绿肥在贫瘠的土壤中生长，从而提升土壤质量。我国已在浙江、福建、江苏等地广泛种植紫云英、苜蓿、三叶草等豆科固氮植物，作为绿肥或者牲畜食料。

实践证明，接种与不接种根瘤菌关系到绿肥植物收获量的多少，但由于人工接种的根瘤菌剂与土著根瘤菌之间存在竞争性，往往不能达到预期的接种效果[2]，也阻碍了固氮菌株应有效用的发挥。近年来在竞争结瘤机制和根瘤菌寄主特异性方面的研究取得了许多进展，对根瘤菌竞争结瘤相关基因及豆科植物的寄主专一性结瘤相关基因均有了一定的认识。其中根瘤菌本身的基因型对竞争结瘤能力具有重要影响，目前已经报道了根瘤菌的运动性、趋化性、细菌素的产生[3]、生长繁殖速度、细胞表面特征、结瘤相关基因[4]，如大豆慢生根瘤菌中的nfeC基因[5]、中华苜蓿根瘤菌中的nifA基因等[6]，它们在结瘤竞争力方面发挥了重要的作用。

影响竞争结瘤的因素复杂多样，解决方案也很多，但筛选使用竞争结瘤能力高的根瘤菌和选育抑制土著根瘤菌结瘤的植物品种是最佳的途径。陈华癸等最先在我国分离获得紫云英根部有效结瘤的菌株中慢生华癸根瘤菌[7]，目前在田间试验中被广泛接种应用的是具有良好结瘤固氮能力的7653R，该菌株同时还作为中慢生紫云英根瘤菌的典型菌株，其基因组已由华中农业大学初步完成测定。本研究从不同生境环境紫云英的根部瘤体中分离了9株紫云英根瘤菌，比较了其在不同品种紫云英根部结瘤的能力，同时还研究了其与典型菌株7653R共同接种时的竞争结瘤能力，初步获得了1株与7653R结瘤能力相当的菌株，为后续大田的接种使用提供了材料，同时也为后续研究竞争结瘤能力相关的遗传学分析提供了新的试验对象。

1材料与方法

1.1供试菌株与材料

试验所用菌株为中慢生华癸根瘤菌7653R，由华中农业大学馈赠。其他9株紫云英根瘤菌分离自不同生境紫云英根部瘤体内。根瘤菌培养所用培养基均为TY培养基[8]，所用抗生素浓度为利福平（Rif）20μg/mL、链霉素（Str）100μg/mL。

紫云英种子闽紫5号由福建省土壤肥料所提供，粤肥1号、信阳种、弋江种、宁波大桥和闽紫6号由浙江省农业科学院提供；蛭石购自南京农业大学芳华园艺中心。

1.2种子表面消毒与催芽

将紫云英种子放入无菌三角瓶中，无菌水清洗数次以洗去种子表面的尘土；75%乙醇处理5min，无菌水洗3次；5%NaClO处理3min，无菌水洗10次以洗净种子表面残留试剂；加入适量的无菌水浸泡3h使其充分吸水膨胀，随后分装至平板中，使种子单层均匀地铺开；将种子于22℃黑暗中倒置催芽（在平板盖底部洒些无菌水以保持湿润的催芽环境），约24h后种子露白，即可种植。

1.3确定紫云英植株品系及菌株

分别以粤肥1号、信阳种、弋江种、宁波大桥、闽紫6号和闽紫5号共6个品系紫云英种子作为宿主植物，活化中慢生紫云英根瘤菌菌株至D600nm约为2.0，浸泡已发芽紫云英种子20min，种植入一次性杯子盛装的无菌蛭石中，设置温室温度为白天16℃、12h，黑夜22℃、12h，适时适量浇灌无菌水和无氮营养液。每组种植6盆，每盆5株苗，待第1张真叶长出后，间苗，留下生长状态趋于一致的20株苗；同时接种无菌水处理作为空白对照。分别在15、30d时观察结瘤情况，以结瘤情况确定竞争结瘤试验的供试菌株和紫云英种子品系。

1.4竞争结瘤试验

TY培养基中活化根瘤菌细胞密度至D600nm约2.0，将7653RStr抗性突变株菌液与其他根瘤菌Rif抗性突变株培养菌液等体积（4mL∶4mL）混合，振荡混匀，浸泡紫云英种子20min，种植，以单独接种处理组作为对照；以接种无菌水处理作为空白对照。每组处理设置20株紫云英重复。

1.5根瘤数量、根瘤重量统计及菌体分离

小心拆盆，轻轻抖落根部蛭石，剪取每颗根瘤，记录瘤数、瘤质量。将单个根瘤瘤体置于1.6%NaClO下处理1min进行表面消毒杀菌，水洗4次，去除残留药物。将表面消毒后的单个根瘤置于1.5mL离心管中，捣碎后用500μL无菌水悬浮，振荡混匀后，取100μL该菌液到900μL无菌水中，依次进行梯度稀释至10-4。对于单独接种根瘤菌的紫云英植株，每个梯度各取10μL点样于TY空白板，待长出单菌落后，计数；对于混合接种根瘤菌的紫云英植株根瘤，每个梯度各取10μL点样于分别含有Str100μg/mL、Rif20μg/mL的TY平板上，待长出单菌落后，计数。endprint

2结果与分析

2.1确定紫云英植物品系及根瘤菌菌株种类

从不同生境紫云英根部瘤体分离到了9株根瘤菌，分别单独接种至6个品系的紫云英种子，在15、30d时观察结瘤情况，以7653R菌株作为阳性对照菌。如表1所示，从根瘤菌结瘤专一性看，8、9号菌株与紫云英共生结瘤的专一性很强，在15d时只与信阳种共生结瘤；而1～7号菌株对宿主的专一性较低。从紫云英植物宿主的专一性看，信阳种、弋江种和宁波大桥种对菌种的专一性较其他品系要低：15d时，信阳种可以与所有测试菌株共生结瘤；30d时，弋江种、宁波大桥种均能和所有菌株共生结瘤。

2.2紫云英根瘤菌分离菌株与其Rif抗性菌株结瘤能力的鉴定

在以上结瘤试验基础上，选用可以与所有测试菌株有效结瘤的宁波大桥种作为后续紫云英根瘤菌竞争结瘤试验的宿主植物，1～7号菌株作为根瘤菌侵染对象。为了区分瘤体内紫云英根瘤菌的种类，需要选择合适的筛选标签，抗生素是被广泛应用的标签之一[9]。本研究筛选获得了1～7号7株紫云英根瘤菌的Rif自发突变抗性株Z1-Z7，检测了Rif抗性的产生是否会影响原有根瘤菌的结瘤能力。

分别将野生型菌株与Rif抗性株单独接种到紫云英植株，结果如图1所示，野生型和Rif抗性突变株根瘤数量、根瘤质量均无显著差异，因此后续可以用Rif抗性突变株代表野生型菌株进行与7653R间的竞争结瘤试验。

[FK（W20][TPDHM1.tif][FK）]

2.3紫云英分离菌株与7653R间的竞争结瘤

在实践中接种根瘤菌剂到土壤中时，根瘤菌剂与土著菌的浓度未知、二者之间的数量比值也不确定。在本竞争结瘤试验中，设置了2种接种液浓度，为了更接近于实际菌剂接种中的细胞密度，分别设置了1.0×106CFU/mL和1.0×107CFU/mL2种接种液浓度，浸泡已轻微发芽的紫云英种子，各20个重复。

在接种后30d时，统计各处理的根瘤菌总数和结瘤数量。结果发现，在结瘤数量上，1、2、5、7号菌株与7653R混合接种处理后，根瘤数量比单独接种处理组时稍少（图2），3号菌株与7653R混合接种后结瘤数量比单独接种时稍多。在瘤体质量上，仅4号菌株混合接种的瘤体质量低于单独接种菌株。这说明菌种之间的竞争可能会影响植株的结瘤情况，但影响都不显著。

在2种不同根瘤菌共同接种过程中，竞争性结瘤主要是通过比较瘤体内根瘤菌的数量比率，即占瘤率来衡量的[10]。将7653R和1～7号菌株分别1∶1混合接种至紫云英根部，30d后，统计每处理中根瘤菌的占瘤率情况。如图3所示，在所有类型的混合接种处理中，86.96%～94.29%的瘤体都是单个根瘤菌侵染形成，而2种不同根瘤菌共同侵占同一瘤体的比率只有5.71%～13.04%，该结果与Gage等的研究结果

一致[11]。在所有的共同接种试验中，多数菌株（1、3、4、5、6、7号菌株）的竞争性都不同程度地弱于7653R，占瘤率仅是7653R的43%～62%，尤其是1号菌株的定殖能力最弱，约是7653R占瘤率的9%。该结果显示出了传统大田应用菌株7653R良好的竞争能力，但同时也表明，2号菌株在瘤体中的占瘤率为48.77%，与7653R的竞争能力相当（42.44%），这显示了不同紫云英根瘤菌竞争能力的差异。

根瘤菌竞争能力的比例还可以通过考察2种根瘤菌共同占据的瘤体内根瘤菌的数量比例。将图3中2种根瘤菌共同占据的瘤体捣碎后，进行梯度稀释计数，据抗性计算其中2种不同根瘤菌确切的细菌数量，计算数量比值。如图4所示，在7653R与紫云英分离菌株共同占据的瘤体内，7653R与不同根瘤菌的数量比均接近1，其数量相当。

3讨论

将紫云英根瘤菌经典菌株7653R与分离自不同生境的9株紫云英根瘤菌菌株，分别单独接种于闽紫1号、闽紫6号、粤肥2号、弋江种、信阳种、闽紫5号、宁波大桥共6个品系的紫云英植株，确定结瘤专一性较低的7株紫云英根瘤菌和宁波大桥种子作为后续竞争试验的研究菌株。

在7653R和1～7号菌株间进行竞争结瘤，结果发现单接处理组之间、混接处理组之间在根瘤数量、根瘤质量、结瘤时间方面均无显著差异。在统计了不同根瘤菌的占瘤率后，确定了2号菌株竞争性较强，与7653R占瘤率相当，其他检测菌株则都低于7653R，尤其是1号菌株，其占瘤率仅是同时接种的7653R占瘤率的9%。在同时含有2种根瘤菌的根瘤内，7653R和混合接种的紫云英根瘤菌菌数比值多在0.1～10，且多集中在1附近，说明二者在同一根瘤内部的定殖能力相近。

根瘤菌与植物的共生固氮是二者之间不断发生信号交流互作的过程，该过程还包括不同根瘤菌之间的竞争，人工接种的根瘤菌菌剂要取得良好的施肥效果，首先需要具有一定的与土壤中原有根瘤菌竞争的能力。已有的研究结果表明，影响根瘤菌竞争结瘤的因素主要是根瘤菌与宿主植物的遗传因素，也和土壤的生态环境相关。将同一种根瘤菌接种到不同基因型的植株结瘤，其结瘤能力表现不同，即根瘤菌对宿主植物基因型有一定的依赖性，如有研究表明大豆的隐性基因rjl能抑制许多大豆慢生根瘤菌的结瘤[12]。根瘤菌本身基因型对竞争结瘤能力也有重要影响，一些根瘤菌产生的细菌素可抑制其他对该细菌素敏感的根瘤菌，如可以产生三叶草素的豌豆根瘤菌三叶草型T24菌株，可抑制对三叶草素敏感的菌株的结瘤，但三叶草素抗性菌株的结瘤则不受其抑制。田间试验也证实，产生三叶草素的工程菌株比不产三叶草素菌株在占瘤率方面至少高20%，且在产量方面，也不逊于接种不产三叶草素的作物[3]。

本试验结果对菌剂接种有一定的理论指导意义。将竞争能力与7653R相当的2号菌株制成菌剂可以接种到紫云英根部，最大限度地排斥土著根瘤菌，增强接种效果，以充分发挥生物固氮的作用，减少化肥的施用。在后续研究中，还可以将根瘤菌接种于不同品系的紫云英，考察不同的根瘤菌与何种品系紫云英植株共生结瘤能力最强，从而有针对性地进行根瘤菌菌剂的定向接种，提高接种效率，用最低的成本改善土壤环境或得到更多的鲜草量。endprint

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