GC-MS 结合化学计量学对5 个产地牡丹皮提取物的比较分析

胡云飞， 吴德玲， 徐国兵，2* ， 徐 倩， 蒋 磊，3， 吴 虹

(1. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥230031;2. 安徽省食品药品检验研究院，安徽 合肥230051;3. 安徽省亳州市食品药品检验中心，安徽 亳州236800)

牡丹皮Moutan Cortex 为毛茛科植物牡丹Paeonia saffruticosa 的干燥根皮，是安徽省道地药材之一，始载于《神农本草经》，被列为中品，具有清热凉血，活血散瘀之功效。牡丹在我国具有悠久的药用和栽培历史，其花被选为国花，因该植物产地及加工方法的不同，形成了道地药材与一般药材，如凤丹皮、瑶丹皮、川丹皮、西丹皮、黄丹皮等，而且根据加工方式，它又可被分为刮丹皮与原丹皮［1-3］。国内外对牡丹皮药理作用的研究较多［4］，但对不同产地该植物的GC-MS 比较分析却鲜有报道，本实验采用GC-MS 联用技术，对铜陵、亳州、垫江、运城、嘉兴这5 个产地的牡丹皮提取物进行分析，从而比较道地药材与非道地药材的差异性。

主成分分析 (principal components analysis，PCA)是目前应用比较广泛的化学计量方法，因其能简化数据，故可快速实现模式化关系的可视化识别，被广泛运用于现代中药复杂体系的分析［5-11］。另外，偏最小二乘辨别分析(partial least squaresdiscriminant analysis，PLS-DA)是一种基于PLS 回归的辨别分析分类方法，具有高效的鉴别能力。因此，运用PCA 与PLS-DA 对GC-MS 实验结果作进一步验证，可为牡丹皮药材的质量评价与道地药材的鉴别提供依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 Bruker 450 GC-320 气相色谱-质谱联用仪，包括CTC 全自动进样器、MS Workstation 色谱工作站(德国Bruker 公司);DB-5 色谱柱(美国HP 公司);NIST 05 标准质谱图库(德国Bruker 公司);S30H-D78224 超声清洗器(德国Elma Sonic 公司);AL204 分析天平(0.001 g，瑞士Mettler-Toledo 公司);FD115 电热干燥箱(德国Binder 公司)。

1.2 试剂与材料 甲醇为色谱纯(美国Tedia 公司)，使用前经0.45 μm 滤膜滤过;其他试剂均为分析纯。牡丹皮药材分别采自铜陵、亳州、垫江、运城、嘉兴，均为三年生，经安徽省食品药品检验研究院黄丽丹主任中药师鉴定，均为毛茛科植物牡丹Paeonia saffruticosa Andr 的根皮。各产地药材按照《中国药典》2010 年版［12］方法统一制备，具体信息见表1。

表1 牡丹皮样品来源Tab.1 Resoures of samples of Moutan Cortex

1.3 实验条件

1.3.1 提取方法 取鲜牡丹皮适量，去除杂质后洗净，晾至外表面无水分，再去除木心部，40 ℃下烘干，制备成牡丹皮饮片。然后，精密称取其中1.0 g，加入甲醇10 mL，超声提取，过滤，定容至10 mL 量瓶中，摇匀，再用0.22 μm 微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

1.3.2 色谱条件 DB-5 色谱柱 (30 m × 0.25 mm，0.25 μm);进样口温度250 ℃，升温程序为起始温度80 ℃，2 ℃/min 速率升至160 ℃，保持2 min，10 ℃/min 速率升至260 ℃，保持2 min;载气为高纯氦气;体积流量1.0 mL/min;分流比5 ∶1;进样量1 μL。

1.3.3 质谱条件 质谱接口温度250 ℃;EI 离子源，温度200 ℃;电子轰击电压70 eV;全离子扫描，扫描范围(m/z)33 ～350;采集延时2 min;图谱采集时间52.0 min。归一化法计算含有量。

2 结果

按照“1.3.1”至“1.3.3”项下方法和条件，分别对牡丹皮进行提取分析，得到总离子流图，见图1。然后，通过检索NIST 05 数据库，以匹配度大于750 为筛选依据［13］，初步鉴定了其中41 个挥发性成分，并通过面积归一化法计算各成分的相对百分含有量，结果见表1。

表1 牡丹皮提取物挥发性成分Tab.1 Volatile constituents of Moutan Cortex extract

3 讨论

3.1 GC-MS 分析牡丹皮提取物的化学成分及相对含有量 本实验采用GC-MS 联用技术测定牡丹皮提取物的化学成分，结果从5 个产地的药材中鉴别出41 个成分，其中共有成分21 个，见图1。由图可知，这些成分主要为芳香族和脂肪酸类化合物，占总量的80%以上，其中丹皮酚、苯甲酸、邻苯三酚的含有量最高。以丹皮酚为例，5 个产地的相对含有量分别为26.61%、31.59%、25.25%、32.80%、27.79%，说明不同产地的牡丹皮提取物在主要成分的含有量上存在一定差异。另外，铜陵产丹皮(又称“凤丹”)与其他产地相比，存在2-furanmenthanol，tetrahydro-5-methyl-trans-(6 号峰)、油酸(30 号峰)等特征峰，可能是其作为道地药材，在化学成分种类上的差异。

图1 显示，保留时间9.56 min (A)处为苯甲酸与苯甲酰混合物，表现为锯型峰;保留时间19.78 min (B)处为没食子酰类化合物，表现为拖尾峰，由于GC-MS 的局限性，故需HPLC 等检测方法作进一步分离。这两类化合物的相对含有量分别达到24.30%和14.73%，与文献［14-15］关于牡丹皮中含有大量没食子酰葡萄糖类和苯甲酰类化合物的报道一致。

图1 牡丹皮药材的GC-MS 总离子流图Fig.1 GC-MS total ion chromatograms of Moutan Cortex

3.2 PCA 与PLS-DA 对结果的验证

3.2.1 PCA 对结果的验证 将各产地牡丹皮药材的数据(各5 个样本)导入SIMCA-P 11.0 版，以样本成分的峰面积为特征值，将数据标准化后进行无监督的主成分分析(PCA)和有监督的偏最小二乘辨别分析(PLS-DA)，结果发现前两个组分贡献的总方差为78.8%，见图2。由图可知，5 个产地的药材在主成分空间的分布上较分散，各产地样本均处于相对独立的空间，得到了有效区分，说明不同产地的药材提取物有着一定程度上的区别。另外，从疏密度方面来看，铜陵和亳州产相对较为集中，而嘉兴和运城产较为分散，可能是由于受地理、气候等因素影响，其化学成分的富集也有所不同，地理分布越接近的居群，其主成分空间的分布位置也越接近，这种分布上的差异也验证了GCMS 的分析结果。

图2 不同产地牡丹皮的PCA 得分图Fig.2 PCA score plot of Moutan Cortex from different regions

3.2.2 PLS-DA 对结果的验证 在PCA 分组的基础上，本实验进一步作有监督的PLS-DA 辨别分析，结果识别模型的解释度(R2Y)为72.5%，模型的预测度(Q2Y)为67.5%，故可认为各成分含有量的R2X 为78.7%。然后，对牡丹皮进行分组比较，见图3，再按变量对分组的贡献率(VIP)大小进行排序，见图4。其中，2-氨基乙醇、2-methyl-Z，Z-3，13-octadecadienol、丁腈，2，3-二氧-，二肟，O，O'-二乙酰、(1，1'-bicyclopropyl)-2-octanoic acid，2'-hexyl-，methyl ester (-)、3-乙氧基苯甲酸的VIP 均＞1.2，表明这几个组分为不同产地分组的主要生物标记物，即以上5 种成分在不同产地药材的富集中具有一定差异性。

图3 不同产地牡丹皮药材的PLS-DA 得分图Fig.3 PLS-DA score plot of Moutan Cortex from different regions

图4 各变量对分组的贡献值(VIP)Fig.4 Contribution values of each variable to grouping(VIP)

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