狗脊不同炮制品的抗炎作用及其机制研究

赵敏杰， 鞠成国， 林桂梅， 张 凡， 贾天柱*

(1. 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连116600;2. 辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连116600;3. 国家中医药管理局中药炮制重点研究室，辽宁 大连116600)

类风湿性关节炎(RA)是一种以关节滑膜炎为特征，以对称性多关节炎为主要临床表现的异质、系统、慢性自身免疫功能障碍疾病，严重影响了人们的身心健康和生活质量，目前关于其具体的病理和发病机制尚未完全明确。狗脊作为传统祛风湿中药，具有祛风湿、补肝肾、强腰膝之功效［1］，对肾阳虚佐剂性关节炎(DK-AA)及佐剂性关节炎(AA)大鼠具有治疗作用［2-3］，而且对二甲苯致小鼠耳廓肿胀也有一定疗效［4］，并通过热板法、扭体法、毛细玻管法、断尾法，从体内抗炎和镇痛两方面研究了生、烫狗脊的镇痛作用和治疗RA 的效果［5-6］，但对其体外抗炎作用方面的报道较少，而且机制也不明确。

细胞因子和炎症介质被广泛应用于抗炎作用机制研究，而本实验以脂多糖(LPS)刺激小鼠单核巨噬细胞RAW264.7 为体外抗炎模型，以细胞上清液中细胞因子和炎性介质的检测总评分为评价标准，进一步探讨狗脊的抗炎作用及其机制，并对各炮制品进行比较来明确其作用差别，为治疗RA 提供科学依据和参考，有利于临床灵活辨别使用。

1 实验材料

FA1004B 电子天平(上海精密科学仪器有限公司);微量移液枪(美国Thermol 公司);METTLER AE240 分析天平(十万分之一，瑞士Mettler公司);Multiskan-MK3 酶标仪(赛默飞世尔科技中国有限公司);ZHJH-C1112B 超净工作台(上海智城分析仪器制造有限公司);NIB-100 倒置显微镜(宁波永新光学股份有限公司);MCO-15AC CO2培养箱(日本三洋公司);Alpha 1-4 冷冻干燥机(德国Christ 公司);KES-21AS20 电陶炉(深圳市康佳电器有限公司)。

LPS (美国Sigma-Aldrich 公司);TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、NO、小鼠血清ELISA 试剂盒(上海科兴贸易有限公司);RAW264.7 细胞株(ATCC)、DMEM 高糖培养基、胎牛血清(美国Thermo Scientific 公司);水为娃哈哈纯净水。

狗脊饮片采自广西省河池市，经辽宁中医药大学王冰教授鉴定为蚌壳蕨科植物金毛狗脊Cibotium barometz (L.)J. Sm 的干燥根茎。

2 方法

2.1 狗脊不同炮制品及其含药培养基的制备

2.1.1 烫狗脊的制备［7］取净河砂400 g，置于炒制容器内，武火(180 ～190 ℃)加热至滑利状态，加入净狗脊片50 g，翻炒6 min 后取出，即得。

2.1.2 盐狗脊的制备［8］取净狗脊片50 g，加入含盐1 g 的盐水40 mL，保鲜膜密封，浸润2 h 后武火蒸制3 h，再停火闷润4 h，取出干燥，即得。

2.1.3 蒸狗脊的制备 取净狗脊片50 g，加入清水40 mL，保鲜膜密封，浸润1 h 后放入锅内，武火蒸制4 h，再停火闷润4 h，取出干燥，即得。

2.1.4 酒狗脊的制备［9］取黄酒7.5 g，稀释至40 mL，加入净狗脊片50 g 拌匀，保鲜膜密封，浸润2 h 后放入锅内，武火蒸制4 h，再停火闷润4 h，取出干燥，即得。

2.1.5 狗脊各炮制品水煎液的制备 取“2.1.1”～“2.1.4”项下炮制品适量，分别加入10 倍量水煎煮，每次1 h，煎煮3 次，合并滤液，浓缩至相当于生饮片质量浓度为20 g/L 的溶液，冷冻干燥，再用DMEM 培养基配制相当于生药浓度为20 μg/mL的溶液，即得。

2.2 RAW264.7 细胞的培养 采用含10%胎牛血清的DMEM 培养基，于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下的培养箱中培养。

2.3 抗炎作用的测试方法 ELISA 法测定细胞上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 以及炎性介质PGE2和NO 的浓度，然后刮取对数生长期的RAW264.7 细胞，以4 ×105个/mL 的细胞密度接种于96 孔板上，每孔100 μL，培养24 h。待细胞贴壁后，更换无血清培养基以使周期同步化，培养24 h 后吸取，然后加入狗脊的不同炮制品(生狗脊、烫狗脊、盐狗脊、蒸狗脊、酒狗脊)和含LPS(终质量浓度为1 mg/L)的混合液100 μL，设置LPS 模型组和空白对照组(加入DMEM 无血清培养基100 μL)，每组6 个复孔，于37 ℃、5%CO2饱和湿度条件下的培养箱中继续培养24 h。然后，通 过 小 鼠 TNF-α、IL-1β、IL-6、PGE2、NO 的ELISA 试剂盒，对其浓度分别进行检测。

2.4 统计学方法 采用单因素方差分析，SPSS 19.0 软件进行统计学处理。

3 结果

3.1 各炮制组对LPS 刺激RAW264.7 细胞合成的炎性细胞因子及介质的影响 与空白组比较，模型组LPS 刺激RAW264.7 细胞合成的炎性细胞因子及介质的量均显著增加，差异有统计学意义(P ＜0.01)。另外，与模型组比较，各炮制组细胞上清液中这些物质的量均明显降低，具有显著性差异(P ＜0.05)，见表1。

3.2 狗脊各炮制组抗炎作用机制指标总评分 根据作用机制指标的单因素方差分析结果，对狗脊各炮制组进行评分，最接近对照组者计5 分，次之计4 分，以此类推，最接近模型组者计1 分，结果见表2。由表可知，总评分由高到低，依次为生狗脊(22 分) ＞烫狗脊(18 分) ＞酒狗脊(15 分) ＞盐狗脊(12 分) ＞蒸狗脊(9 分)。

表1 各炮制组对LPS 刺激的RAW264.7 细胞合成炎性细胞因子及介质的影响(±s，n=6)Tab.1 Effects of all processed groups on LPS stimulated RAW264.7 cells at the levels of inflammatory cytokines and mediators (±s，n=6)

表1 各炮制组对LPS 刺激的RAW264.7 细胞合成炎性细胞因子及介质的影响(±s，n=6)Tab.1 Effects of all processed groups on LPS stimulated RAW264.7 cells at the levels of inflammatory cytokines and mediators (±s，n=6)

注:与对照组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与模型组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别 IL-1β IL-6 TNF-α PEG2 NO对照组 35.571 ±0.998## 59.343 ±1.637## 222.212 ±4.856## 191.600 ±10.205## 24.468 ±1.387##模型组 66.120 ±1.729＊＊ 107.938 ±1.072＊＊ 423.035 ±7.418＊＊ 340.798 ±13.361＊＊ 54.435 ±0.524＊＊生狗脊 38.452 ±1.729* ## 72.564 ±2.144＊＊## 285.443 ±4.856＊＊## 227.229 ±13.361＊＊## 28.706 ±0.908＊＊##盐狗脊 53.430 ±0.998＊＊## 88.643 ±3.865＊＊## 311.343 ±7.418＊＊## 233.910 ±6.680＊＊## 37.181 ±2.285＊＊##蒸狗脊 56.321 ±0.998＊＊## 76.852 ±2.144＊＊## 309.724 ±4.856＊＊## 309.622 ±7.714＊＊## 45.052 ±0.908* ##烫狗脊 47.099 ±1.729＊＊## 58.990 ±1.637## 236.881 ±4.856＊＊## 249.498 ±10.205＊＊## 27.192 ±0.524＊＊##酒狗脊 46.522 ±0.998＊＊## 77.5664 ±1.637＊＊## 220.694 ±2.807# 256.178 ±10.205＊＊## 34.154 ±0.908＊＊##

表2 各炮制组的作用机制评分Tab.2 Scores of mechanisms of action of all processed groups

4 讨论

类风湿性关节炎活动期多属湿热痹范畴，而炎症是痹症的主要病理反应之一。由于狗脊作为传统中药，具有祛风湿功效，因此本实验从炎性因子和介质靶点作用两方面选取相应检测指标，用于深入探讨其作用机制。炎症是机体对外来刺激产生的一种病理反应过程，其症状表现为红、肿、热、痛，病理检查可发现有大量炎症细胞(如粒细胞、巨噬细胞)的局部浸润和组织坏死。在此过程中，一些细胞因子起着重要的促进作用，而IL-1、IL-6、TNF-α 是介导炎症的主要细胞因子，可促进炎症细胞的聚集和活化，以及炎症介质的释放，在类风湿性关节炎发作时，就可检测到上述细胞因子的水平升高，并在类风湿性关节炎局部和全身免疫反应中起到重要作用。IL-1β 是类风湿性关节炎中发生关节软骨破坏最重要的一种细胞因子，在类风湿血管翳的形成中具有关键性影响，因此称其为“中心犯罪”。TNF-α 可刺激滑膜和软骨细胞合成PEG2及胶原酶，并引起骨和软骨细胞破坏，促进成纤维细胞增生;IL-6 既能增强滑膜纤维细胞尿激酶型纤维，也能促进其抑制因子(PAI-1)和金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)的形成，故在关节破坏和修复中占有重要作用;PGE2和NO 是重要的炎性介质，其中PGE2具有致热和致痛作用，是参与滑膜关节周围组织的炎症、软骨破坏及增生等病变的主要炎性介质，而NO 则可通过增加局部血流，促进血浆渗出和水肿形成。因此，选择IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2、NO 作为抗炎指标对于“祛风湿”这一功效具有一定代表性。

在炎症反应中，LPS 激活的RAW264.7 模型被广泛应用于评价各物质的抗炎作用，其中LPS 是革兰氏阴性细菌细胞壁的毒性物质，在与RAW264.7 的Toll 受体结合后，能激活巨噬细胞，使其释放出多种能诱导炎症发生的细胞因子和炎性介质，并且IL-1、IL-6、TNF-α、PGE2、NO 均可由其产生。因此，本实验选择LPS 刺激单核巨噬细胞为体外抗炎模型［10-15］。

经上述分析及实验结果，本实验构建了IL-6 TNF-α 以及IL-1 NO 和PGE2这一整条炎症形成的信号通路，但仅从炎性因子角度考虑狗脊的祛风湿功效，就类风湿性关节炎这一痹症来说还不够完善，因为其病因和病机比较复杂，而狗脊治疗的作用效果体现在各个环节，作用强度不等。如果按照对炎性细胞因子的影响划分，则生狗脊和烫狗脊的抗炎作用最好，其次是酒狗脊、蒸狗脊、盐狗脊;如果按照对炎性介质的影响划分，则依次为生狗脊＞盐狗脊＞烫狗脊＞酒狗脊＞蒸狗脊;如果按照作用机制指标的总评分划分，则依次为生狗脊＞烫狗脊＞酒狗脊＞盐狗脊＞蒸狗脊。其中，在炮制方法方面，生狗脊抗炎效果最好;在加热方式方面，干热砂烫法优于湿热水蒸法;在辅料方面，黄酒优于食盐。本实验通过综合评分，筛选出生狗脊抗炎效果最强，符合“生狗脊以祛风湿、利关节为主，制品以补肝肾、强腰膝为主”这一传统炮制理论。

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