二次通用旋转组合设计优化红芪中芒柄花素和总皂苷的酶解提取工艺

王继龙， 陈方圆， 魏舒畅 ， 高建德， 范凌云， 余 琰

(甘肃中医药大学，甘肃 兰州730000)

酶解法提取中药材时，可在温和条件下通过破坏细胞结构，从而减小成分扩散时的传质阻力，不但有效成分提取率高，提取时间短，而且能保持天然产物的立体构型和生物活性［1-3］。红芪为豆科植物多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz 的干燥根［4］，具有补气养血、消肿排脓、固表止汗等功效，由于该植物属于纤维性根茎药材，富含纤维素、半纤维素、果胶等易造成传质阻力的物质，故适合复合酶酶解法提取，但目前相关的研究报道较少。由于二次通用旋转组合设计具有旋转性，可克服均匀设计、正交设计、回归正交设计等方法的不足［5-7］，因此本实验采用该方法对红芪中芒柄花素和总皂苷的复合酶提取工艺条件进行优化，期冀为红芪等纤维性根茎类药材中黄酮及皂苷类成分的提取制备提供参考。

1 仪器与材料

Waters 600E-2487 HPLC 色谱仪，包括在线脱气机、四元泵、自动进样器、紫外检测器(美国Waters 公司);ABT100-5M 分析天平(德国Kern公司);UV Blue Star B 紫外-可见分光光度计(北京莱伯泰科仪器有限公司)。

芒柄花素对照品(纯度≥98%，批号111703-200602，中国食品药品检定研究院);果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶(比活力分别为1.5 ×105、1.4×106、1.0×107u/g，甘肃华羚生物科技有限公司)。红芪药材购自甘肃省武都区，经甘肃中医药大学药学院魏舒畅教授鉴定为多序岩黄芪Hedysarum polybotrys Hand.-Mazz 的干燥根。甲醇为色谱纯(德国Merck 公司);其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 芒柄花素的测定

2.1.1 色谱条件 Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm);流动相为甲醇-0.2%乙酸(60 ∶40);检测波长255 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温31 ℃;进样量20 μL，结果见图1。

图1 对照品和供试品的HPLC 图谱Fig.1 HPLC chromatograms of reference substances and samples

2.1.2 供试品溶液的制备 取红芪药材100 g，加入4 倍量水和适量酶后混匀，50 ℃下酶解一定时间后加热灭活10 min，补水并回流提取3 次，过滤，浓缩(每1 mL 浓缩液相当于0.25 g 原药材)。然后，精密吸取浓缩液10 mL，乙酸乙酯萃取3次，每次20 mL，合并萃取液，水浴挥干，残渣加甲醇溶解，定容于10 mL 量瓶中，摇匀后过滤，取续滤液，即得供试品溶液。

2.1.3 对照品溶液的制备 精密称取芒柄花素对照品1.01 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解，定容至刻度。然后，精密吸取溶液适量，加不同体积甲醇稀释，即得一系列质量浓度的对照品溶液。

2.1.4 线性关系的考察 取“2.1.3”项下方法制得的对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件测定，以峰面积(y)对质量浓度(x，μg/mL)进行线性回归，结果得到回归方程y=1.27 ×105x+1.80×104，r=0.999 9，表明芒柄花素在0.020 2 ～0.323 2 μg 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.1.5 精密度试验 取“2.1.3”项下方法制得的对照品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件重复进样6 次，测定RSD 值。结果，芒柄花素峰面积的RSD 为0.96%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取“2.1.2”项下方法制得的供试品溶液适量，按“2.1.1”项下色谱条件，分别于0、6、12、24、48 h 进样测定RSD 值。结果，芒柄花素峰面积的RSD 为1.62%，表明供试品溶液在48 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 精密量取红芪浓缩液适量，按“2.1.2”项下方法平行制备供试品溶液6 份，按“2.1.1”项下色谱条件分别进样测定RSD 值。结果，芒柄花素峰面积的RSD 为1.32%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密量取红芪浓缩液9份，每份5 mL，再分别精密加入芒柄花素对照品适量，加水至10 mL，按“2.1.2”项下方法制备高、中、低3 个质量浓度的加样回收样品溶液，每个浓度平行制备3 份，分别按“2.1.1”项下色谱条件进样测定RSD 值。结果，芒柄花素的平均回收率为99.45%，RSD 为1.52%，表明回收率良好。

2.2 总皂苷的测定 精密量取“2.1.2”项下制得的浓缩液10 mL，水饱和正丁醇萃取4 次，每次分别为15、15、10、10 mL，合并萃取液，氨试液反萃2 次，每次5 mL，弃去氨水层，水浴挥干，残渣加甲醇溶解，定容于25 mL 量瓶中。然后，采用差示比色法［8］，并按回归方程ΔA=2.637 4 m-0.000 8 (r=0.999 3)计算总皂苷含有量。

2.3 复合酶比例的确定 根据文献［9］研究报道，固定“2.1.2”项下部分酶解提取条件(酶解2 h，回流提取3 次，每次80 min，总水量24 倍)，应用单因素试验分别考察果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶的用量(0、50、100、200、400 mg)对芒柄花素和总皂苷提取量的影响。结果表明，两者的提取量随着酶用量增加，均呈现先升高后下降的趋势。当果胶酶与木聚糖酶用量均为200 mg、纤维素酶为100 mg 时，提取量均达到最高，但随着酶用量继续增加，提取量均反而下降。因此，本实验确定复合酶的组成质量比为果胶酶∶木聚糖酶∶纤维素酶=2 ∶2 ∶1。

2.4 二次通用旋转组合设计优化试验［10-15］

2.4.1 数学模型的建立与显著性检验 以复合酶用量(x1)、酶解时间(x2)、加水量(x3)和提取时间(x4)为试验因素，采用四元(1/2 实施)二次通用旋转组合设计，优化红芪中芒柄花素与总皂苷的酶解提取工艺，试验设计及结果见表1，方差分析见表2。

表1 二次通用旋转组合试验设计及结果Tab.1 Design and result of quadratic general rotary unitized tests

表2 y1 与y2 方差分析Tab.2 Variance analysis of y1 and y2

y2回归方程的失拟性检验F1=4.912 2，F0.05(5，3) =9.01，F1＜F0.05，不显著，表明本试验无其他因素的显著影响;显著性检验F2=8.661 9，F0.01(11，8) =5.74，F2＞F0.01，极显著，表明所建模型的预测值与测试值很吻合。另外在单因素中，仅x2不显著，剔除α =0.10 的不显著项后，得到简化后的回归方程y2=1.657 4 +0.023 3x1+0.047 0x3+0.056 1x4。

2.4.2 单因素效应分析 采用降维分析方法，对各因素进行单因素效应影响分析，结果见图2。

图2 各单因素与芒柄花素和总皂苷提取量的关系Fig.2 Relationships of each single factor and the extraction volumes of formononetin and total saponin

由图2A 可以看出，y1随着各因素取值增加，均呈先升高后降低的趋势，其中x1对y1影响最大，其次是x3，而x4影响最小;由图2B 可以看出，y2随着各因素取值增加，均呈升高趋势，其中x4对y2影响最大，其次是x3，而x2影响最小。

2.4.3 y1的交互作用效应分析 由表2 可知，回归方程中x1与x2和x1与x3的互作效应对y1有显著影响，因此需对这二组交互作用的因素作效应分析。将两个因素固定在零水平，通过作图即可直观地分析另两个因素间的互作效应，结果见图3。由图3A 可以看出，x2相同时，增加x1即可提高y1;但x2不同时，其变化趋势也不同，其中x2较短时，尽管随着x1增加也可提高y1，但程度不明显，而延长x2时，y1随着x1变化有较为明显的提高。以上结果表明，选择适宜的x1和x2可使y1有较大提高;由图3B 可以看出，x1相同时，y1随着x3变化呈先升高后降低的趋势;当x3一定时，x1对y1也有同样作用趋势。

图3 x1 与x2 和x1 与x3 的交互作用效应Fig.3 Interaction effect of x1 with x2 and x1 with x3

2.4.4 提取工艺的优化与验证 由于试验中不仅存在单因素效应，还有因素间的互作效应，难以从单因素与互作效应的分析中得到最佳工艺组合，同时四元二次回归模型不存在提取量函数的极值。因此，本实验采用频数分析法，分别分析各回归模型以寻找最优提取工艺，结果见表3，可知在95%置信区间内，y1大于56.68 μg/g，y2大于1.62 mg/g。鉴于提取量和实际操作性，确定芒柄花素的最佳提取条件为复合酶用量340 mg，酶解时间110 min，加水量22 倍，提取时间150 min;总皂苷的最佳提取条件为复合酶用量280 mg，酶解时间90 min，加水量22 倍，提取时间190 min。

按照上述提取工艺方法，对优化所得的工艺进行验证，共5 批，按“2.1”和“2.2”项下方法分别进行检测。结果，芒柄花素和总皂苷的平均提取量分别为69.99 μg/g 和1.68 mg/g，RSD 分别为1.20%和1.56%，与预测值(70.60 μg/g 和1.72 mg/g)接近，表明所建立的数学模型具有良好的预测性。

表3 芒柄花素与总皂苷各相关变量的频率分布Tab.3 Probability distributions of each relative variable of formononetin and total saponin

3 讨论

皂苷与黄酮是红芪中的两类主要活性成分，鉴于两者在分子质量大小及水中溶解度方面存在较大差异，本实验同时以总皂苷和芒柄花素为指标，考察酶解提取工艺各因素对其提取量的影响，由此所得到的工艺条件对皂苷及黄酮类物质的提取将有较高的参考价值。

课题组在前期研究［9］中，并未建立起总皂苷的酶解提取数学模型，推测可能是由于样品中有能与香草醛-高氯酸显色、不影响加样回收率并通过差示法无法消除干扰的物质存在。本实验在样品处理时，加入氨试液进行反萃，有利于进一步消除干扰，并提高检测方法的可靠性。应用该方法时，总皂苷的测定结果虽有所下降，但在试验方案不变的情况下，建立起了总皂苷的酶解提取数学模型。

二次通用旋转组合设计因其精度一致和试验次数少等优点，有利于获得理想的提取工艺条件，但其能容纳的因素数有限。因此，本实验首先利用单因素试验，确定了果胶酶、木聚糖酶和纤维素酶的比例，同时通过前期研究，已确定了回流提取次数，而且由于各酶的最适pH 均与红芪水提液的pH 接近，最适酶解温度均为50 ℃，因此本实验不再对其进行考察。由此可见，在该基础上进行工艺优化时，更为简便有效。

在单因素试验中，芒柄花素和总皂苷的提取量起初均随着酶用量增加而升高，但当提取量达到最大值时，随着酶用量进一步增加，提取量均反而降低，其机理有待作进一步研究。

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