NMR 法同时测定注射用丹参多酚酸中的迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B和甘露醇

许 磊， 温时媛， 王跃飞， 王 萌， 潘桂湘， 姜苗苗*

(1. 天津中医药大学，天津市现代中药重点实验室，天津300193;2. 天津国际生物医药联合研究院，中药新药研发中心，天津300457)

丹参系唇形科植物丹参Salvia miltiorrhiza Bunge 的干燥根及根茎，为传统常用中药，具有袪瘀止痛、活血通经、清心除烦等功效［1］。注射用丹参多酚酸是基于传统中药丹参发展而来的一种冻干粉针剂，主要有效成分为丹参多酚酸，具有活血通经功效，制备方法是丹参多酚酸中加入甘露醇等辅料和注射用水，经活性炭除热源，微孔滤膜过滤，再经冷冻干燥所得［2］。其中，甘露醇是冻干粉针剂常用的一种赋型剂，主要作用为膨松骨架和助溶，而辅料是注射剂的一个重要组成部分，也是一种直接进入人体血液循环的物质，与用药安全息息相关，因此对其进行定量测定是非常必要的。

目前，围绕注射用丹参多酚酸质量控制的研究较多［2-6］，测定其主要有效成分酚酸的方法以C18色谱柱为主，但由于甘露醇是极性化合物，不能采用常规的C18柱进行检测，所以尚未有相关报道。本实验通过核磁共振(NMR)技术，建立了同时测定注射用丹参多酚酸中主要有效物质丹酚酸B等成分和赋形剂甘露醇的方法。继欧洲和美国药典收录NMR 定量检测方法［7-8］后，《中国药典》2010年版也将其收载于附录中［9］。研究表明［10-13］，NMR 法具有样品前处理简单、谱图直观、耗时短等优点，能准确检测出制剂中的有效成分和辅料，为中药注射剂中成分的定量测定提供了一种新的手段。

1 仪器与试剂

BRUKER AVANCEⅢ600 超导核磁共振波谱仪，质子激发频率600.23 MHz，配置BBFO 正相观察宽带探头和5 mm 标准核磁样品管 (美国NORELL 公司);METTLER TOLEDO XP6 电子天平(瑞士Mettler-Toledo 公司)。

D2O (氘代度＞99.8%)、3-(三甲基硅烷)丙酸-d4钠盐 (TSP，内标，氘代度 ＞98%)、K2HPO4、NaH2PO4(美国Sigma-Aldrich 公司)。迷迭香酸(批号w10-5-3)、紫草酸(批号w14-8-0)、丹酚酸B (批号w15-5-7)对照品(天津中新药业集团股份有限公司，纯度均大于98%);甘露醇对照品(批号1120B032，北京索莱宝科技有限公司，纯度大于96%)。

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 内标溶液制备 称取K2HPO4、NaH2PO4与内标物TSP 适量，置于量瓶中，用D2O 溶解，定容至刻度线，制成含1.5 mol/L K2HPO4、1.5 mol/L NaH2PO4、0.2 mg/mL TSP 的内标溶液，即得，用于所有实验溶剂。

2.1.2 对照品溶液制备 分别精密称取迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 和甘露醇对照品适量，加入“2.1.1”项下内标溶液，制成质量浓度分别为1.685、1.235、16.21、12.54 mg/mL 的混合溶液，即得。

2.1.3 供试品溶液制备 精密称取注射用丹参多酚酸冻干粉20 mg，加入“2.1.1”项下内标溶液1 mL，转移至5 mm 核磁管中，摇匀，即得，直接用于1H-NMR 测试。

2.21H-NMR 测定条件 所有一维1H-NMR 谱均在25 ℃下采集，脉冲序列zgcppr 抑制水峰;谱宽12 335.5 Hz;弛豫延迟时间20 s;采样点数32 k;扫描次数16 次。然后，为了对其信号进行归属，根据文献［14］，测定指定样品的2D NMR 谱，包括1H-1H-COSY、1H-1H-TOCSY、1H-13C-HSQC 和1H-13C-HMBC。

2.3 计算公式 在“2.2”项条件下采集图谱，对4 种物质以及内标物的定量峰分别进行积分，再按照1H-NMR 内标法，根据积分结果来计算样品的质量［9］，计算公式如下。

注:ATSP和AS分别是TSP 甲基峰和化合物定量峰的积分面积;nTSP和nS分别代表TSP 甲基峰和化合物定量峰的质子个数;WTSP和WS分别是TSP 和化合物的质量;MTSP和MS分别是TSP 和化合物的分子质量。

2.4 样品1H-NMR 图谱分析 注射用丹参多酚酸的一维1H-NMR 图谱见图1。根据图谱与文献［15-17］鉴定丹酚酸B、紫草酸、甘露醇、迷迭香酸，并对其信号进行归属，见表1。

2.5 线性关系考察 精密吸取“2.1.2”项下对照品溶液适量，置于量瓶中，用“2.1.1”项下内标溶液稀释并定容，制备系列质量浓度的混合对照品溶液。然后，分别取适量溶液装入NMR 管中，在“2.2”项条件下采集图谱，以对照品质量浓度(mg/mL)为横坐标(X)，定量峰与内标物峰面积之比为纵坐标(Y)进行线性回归，得到迷迭香酸回归方程为Y =0.348 4X +0.026 2，r2=0.999 3;紫草酸为Y=0.216 7X+0.009 5，r2=0.999 4;丹酚酸B 为Y =0.1647 X +0.047，r2=0.999 7;甘露醇为Y=1.867 7X-0.148 9，r2=0.999 5。由此可知，迷迭香酸在1.685 ～0.105 3、紫草酸在1.235 ～0.077 19、丹酚酸B 在16.21 ～1.013、甘露醇在12.54 ～0.783 8 mg/mL 范围内，与定量质子峰面积的线性关系均良好。

图1 注射用丹参多酚酸的一维1H-NMR 谱(600 MHz)Fig.1 One-dimensional 1H-NMR spectrum of Salvianolate Lyophilized Injection (600 MHz)

表1 注射用丹参多酚酸中丹酚酸B、紫草酸、甘露醇、迷迭香酸的NMR 信号归属Tab.1 NMR assignments of salvianolic acid B，lithospermic acid，mannitol and rosmarinic acid in Salvianolate Lyophilized Injection

2.6 精密度试验 取供试品溶液适量，在“2.2”项条件下连续测定6 次，记录积分面积。结果，计算出RSD (n =6)分别为丹酚酸B 0.24%、紫草酸1.6%、甘露醇0.26%、迷迭香酸0.48%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 精密称取样品适量，共6 份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项条件下进行测定。结果，丹酚酸B 的RSD 为0.55%、紫草酸为1.7%、甘露醇为0.19%、迷迭香酸为2.6%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取同一供试品溶液适量，分别在0、2、4、8、12、18、24 h 进样测定，记录积分面积。结果，计算出RSD (n =6)分别为丹酚酸B 2.2%、紫草酸1.0%、甘露醇0.45%、迷迭香酸0.84%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 精密称取样品10 mg，共6份，分别精密加入丹酚酸B、紫草酸、甘露醇、迷迭香酸适量，配制供试品溶液，在“2.2”项条件下采集图谱，计算回收率，结果见表2，表明该方法回收率良好。

表2 回收率测定结果(n=6)Tab.2 Result of recovery rates (n=6)

2.10 样品测定 按照上述方法，对3 个批号的样品进行定量分析。精密称取样品适量，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项条件下进行测定，记录样品NMR 图谱，计算各成分含有量，结果见表3。

表3 样品测定结果(n=3)Tab.3 Result of determination of samples (n=3)

3 讨论

3.1 溶剂选择 由于供试品均为水溶性成分，故选择重水为溶剂。本实验发现，溶液pH 对NMR图谱有影响，故另配一定浓度的磷酸盐缓冲液来稳定pH。另外，当把样品溶于内标溶液中，不进行任何处理而直接用于NMR 测试时，操作简便，而且能最大程度反映注射剂的真实组成。

3.2 定量峰选择 NMR 定量分析是通过比较特定的吸收峰强度来实现的，所以应选择与其他峰互不重叠的分离较好的峰作为定量峰。通过NMR 一维和二维谱对目标化合物的信号进行全归属，发现迷迭香酸H-8 (6.16，d，J =16.2 Hz)、紫草酸H-8＇(4.21，d，J =5.4 Hz)、丹酚酸B H-8＇ (4.08，d，J=5.4 Hz)的信号峰与其他峰分离良好，因此被选为定量峰，而甘露醇则选择3.88 ～3.9 (2H)作为定量峰，见图2。糖类的端基质子信号一般在δ 4.3 ～5.9 之间，而在注射用丹参多酚酸的1H-NMR谱中没有出现，同时信号归属结果显示，甘露醇各部分的积分面积与其质子数成正比，提示其信号峰未受到其他峰干扰。

图2 迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B、甘露醇的1H-NMR 图谱Fig.2 1H-NMR spectra of rosmarinic acid，lithospermic acid，salvianolic acid B and mannitol

3.3 甘露醇定量 甘露醇为注射用丹参多酚酸的辅料，目前其测定方法有碘量法［9］、紫外-可见分光光度法［18］、HPLC-RID 法［19］和HPLC-ELSD［20-21］法等。其中，碘量法与紫外-可见分光光度法需要经过化学反应，操作繁琐，难以直接测定甘露醇含有量;HPLC-RID 法示差折光检测器灵敏度低，易受外界影响;HPLC-ELSD 法虽较稳定，但甘露醇对色谱柱的要求较高，普通反相C18柱不能保留，需要柱前衍生化，或者用氨基柱和聚合凝胶柱检测;HPLC 法难以解决同时测定多酚酸及甘露醇的问题。而本实验建立的NMR 法是一种无偏向性的检测方法，可以实现注射用丹参多酚酸中迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B 和甘露醇的同时检测。

3.4 小结 中药注射剂在制备工艺上经常需要使用一些辅料，如助溶剂、抗氧化剂、pH 调节剂、等渗调节剂、膨松剂等。近年来，中药注射剂安全问题层出不穷，故辅料的安全性日益受到关注，本实验同时对注射用丹参多酚酸中的有效成分和辅料进行定性和定量分析，对保证制剂的安全和有效具有重要意义。

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