新风胶囊治疗大鼠骨关节炎

阮丽萍， 刘 健 ， 王亚黎， 叶文芳， 万 磊

(1. 安徽中医药大学研究生部，安徽 合肥230038;2. 安徽中医药大学第一附属医院，安徽 合肥230031)

新风胶囊是基于新安思想“健脾治痹”上研制的中成药［1-3］。经过多年的临床疗效检验，并进行了大量的药理实验研究。既往临床研究亦表明［4］，中药新风胶囊具有明显改善膝骨关节炎(Knee Osteoarthritis，KOA)患者膝骨关节炎严重程度指数(LequesneMG)及生活质量的作用，且疗效优于氨基葡萄糖对照组。

骨关节炎是力学与生物学因素共同作用的结果，目前认为主要涉及的机制是关节软骨、细胞外基质、软骨下骨的合成和降解的紊乱［5］。IgG 在临床上有一定的价值，其升高与病程和疾病的严重程度有关。TNF-α、IL-4 是一对经典的炎性细胞因子，在骨关节炎的发病机制中研究相对较为成熟［6］。自噬是机体的一种稳态机制，在免疫和炎症以及抵抗微生物感染中起着至关重要的作用［7-8］。本文旨在通过观察新风胶囊对骨关节炎大鼠外周血免疫球蛋白、软骨及免疫器官胸腺、脾脏中Atg 的表达以及外周血TNF-α、IL-4 的影响，从而分析其治疗骨关节炎的内在机制。

1 材料与方法

1.1 动物 清洁级(SPF)雄性Wistar 大鼠40只，鼠龄5 ～6 月，体质量(170.0 ±20.5)g，由安徽省实验动物中心提供，许可证号SCXK (皖)2011-002。清洁级标准饲养，供试前常规饲养7 d，观察无异常者入组实验。

1.2 材料 新风胶囊:由安徽中医药大学第一附属医院制剂中心提供，批号110521 (HPLC 指纹图谱见图1);氨基葡萄糖，由浙江海正医药有限公司生产，批号20110411;木瓜蛋白酶、L-半胱氨酸，美国MERK 公司(批号MB3052;MB4036)。

图1 新风胶囊HPTLC 指纹图谱(A)，新风胶囊HPTLC指纹图谱三维图(B)［9］Fig.1 HPTLC fingerprints chromatogram of Xinfeng Capsules (A)，Three-dimensional thin-layer chromatogram of Compound Xinfeng Capsules (B)

IL-4、TNF-α、IgG1、IgG2α ELISA 试 剂 盒(批号 E-30418;E-30633;E-30677;E-30766);琼脂糖凝胶(批号111860);DL2000 DNA Marker由日本TaKaRa 公司提供(批号B7301A);Trizol由美国Invitrogen 公司提供(批号14105);氯仿、无水乙醇、异丙醇由上海苏懿化学试剂有限公司提供 (批 号 20120320;20120320;20120210 );DEPC 由 美 国 Sigma 公 司 提 供 (批 号20130119215);QuantiFast SyBr Green PCR kit 由德国Qiagen 公司提供(批号No 204054);6 ×Loading buffer 由 日 本 TaKaRa 公 司 提 供 (批 号A5201A);逆转录试剂盒由美国Thermo 公司提供(批号00145205);GoldView 核酸染料由北京赛百盛基因技术有限公司提供(批号130618)。

1.3 设备 酶标仪(雷杜RT6000);普通PCR 仪(杭州晶格科学仪器有限公司，型号K960);电泳仪(Tanon EPS 300 型);紫外凝胶成像系统(北京科创锐新生物科技有限公司);荧光定量PCR 仪(Thermo PIKOREAL 96);微孔板迷你离心机(杭州奥盛仪器有限公司，型号MINI-P25);光镜(日本产OLYMPUS 光学显微镜)，日产JEM-1230 型透射观察摄片(日本电子公司)。

1.4 方法

1.4.1 膝骨关节炎模型复制及给药 按随机数字表将大鼠分4 组:正常对照组 (Normal control group，NC)，模型对照组 (Model control group，MC)，氨基葡萄糖对照组 (Glucosamine control group，GS)以及新风胶囊组，每组10 只。除正常对照组外，向其余各组大鼠右膝关节注射4%木瓜蛋白酶溶液与0.03 mol/L L-半胱氨酸溶液混合液20 μL，分别于第3、7 天加强，造成KOA 模型［10］。造模后第14 天开始给药，剂量相当于临床病人用量的10 倍。各组给药量如下:正常组与模型组，给予生理盐水灌胃0.01 g/kg，1 mL/100 g;氨基葡萄糖组，氨基葡萄糖细末加生理盐水，配制成混悬液，按0.098 g/kg，1 mL/100 g 剂量灌胃;新风胶囊组，新风胶囊去胶囊壳，加生理盐水，配制成混悬液，按0.375 g/kg，1 mL/100 g 剂量灌胃。1 次/日，连续给药30 d，造模后第49 天取材。

1.4.2 病理观察 取3 ～6 胫骨内侧、胫骨外侧处标本。标本固定72 h，脱钙48 h，常规脱水，石蜡包埋，5 μm 厚度连续切片。HE 染色后，根据关节软骨病理评分标准(Mankin’s Score)进行分级评定。

1.4.3 透射电镜观察软骨自噬情况 (1)取软骨组织1 mm3大小，固定于2.5%戊二醛(4 ℃)4 ～6 h;(2)PBS (pH 7.2)洗2 ～12 h;(3)将组织后固定于1%锇酸1 h;(4)4.30%、50%乙醇脱水各15 min; (5)70%醋酸铀乙醇饱和液中6 ～12 h; (6)80%、95%乙醇脱水各15 min;(7)无水乙醇×2 次，每次40 min; (8)环氧丙烷30 min;(9)环氧炳烷∶环氧树脂(1 ∶1)2 h;(10)环氧炳烷∶环氧树脂(1 ∶2)1 h;(11)浸环氧树脂(Epon812)2 h; (12)环氧树脂包埋，后入45 ℃烤箱中12 h; (13)65 ℃烤箱中48 h;(14)取出包埋好的组织进行超薄切片(片厚70 nm，切片机型号为LKB-NOVA 型，瑞典产);(15)将切好的片子水洗后放入醋酸铀饱和水溶液中30 min; (16)双蒸水洗×3 次，每次15 min;(17)入枸橼酸铅染液15 min;(18)双蒸水洗×3次，每次10 min;(19)透射观察摄片。

1.4.4 ELISA 法检测IL-4、TNF-α、IgG1、IgG2α动物处死后，行腹主动脉采血，将所采血液3 000 r/min 离心5 min，取血清，置-80 ℃冰箱保存待测。具体操作步骤按试剂盒说明书进行。结果判定:在波长450 nm 的酶标仪上读取各孔的光密度(optical density，OD)值;以OD 值为纵坐标，以标准品的浓度为横坐标，绘制曲线图，根据样品的OD 值查找对应的浓度范围。

1.4.5 RT-PCR 检测脾脏、胸腺、软骨自噬相关基因 Atg5 荧光定量引物序列为:正向5’-ATTCCAACGTGCTTTACTCTCTATC-3’，反向5’-AAACCAAATCTCACTAACATCTTCT-3’，产物长度165 bp。大鼠ATG7 荧光定量引物序列:正向5’-GTGTACGATCCCTGTAACCTAACCC-3’，反 向 5’-CGAAAGCAGAGAACTTCAACAGACT-3’，产 物 长度116 bp。大鼠ATG12 荧光定量引物序列:正向5-GGCACCAGCTCTAGGCTTATAGTTG-3 ’， 反 向5’-GTTGTTCCACAGCATTTTCCATG-3’，产物长度124 bp。β-actin:正向5’-CCCATCTATGAGGGTTACGC-3’，反向5-TTTAATGTCACGCACGATTTC-3’，扩增序列150 bp。提取总RNA 后，逆转录反应:(1)在0.2 mL EP 管中，加入总RNA (质量为3 μg)、10 μM Oligo (dT)1 μL，DEPC 水补足至12 μL，轻轻混匀、点动离心; (2)PCR 仪上65 ℃加热5 min，立即冰浴3 min;(3)在上述EP管中加入5 ×反应缓冲液4.0 μL、10 mM dNTP 混合物2 μL、核糖核酸酶抑制剂1 μL、反转录酶1 μL; (4)PCR 仪上42 ℃60 min，70 ℃5min;(5)取出上述反应液，即为cDNA， -80℃保存备用。荧光定量PCR 反应:取出上述反应液1 μL作为荧光定量的模板，反应体系如下，2 ×核酸染料混合物5 μL，10 μM 正向引物1 μL，10 μM 反向引物1 μL，DNA 模板1 μL，灭菌水2 μL，反应总体积为10 μL。反应条件如下:95 ℃5 min (步骤1)，95 ℃10 s (步骤2);60 ℃30 s (步骤3)。步骤2 和3 40 循环。结果及分析包括扩增曲线、熔解曲线以及相对表达量。本次实验所使用的分析方法为relative quantification study，分析所采用的指标为2-△△Ct。

1.5 统计学处理 采用SPSS 17.0 进行统计学处理，连续性变量用±s 表示，样本符合正态性分布，正常组和模型组组间比较采用独立样本t 检验;相关性分析采用Spearman 分析，以P ＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 新风胶囊对KOA 大鼠软骨自噬超微结构的影响 正常组细胞形态良好，细胞浆内可见脂滴，粗面内质网丰富，集中于靠核区域，粗面内质网膜较清晰，胞浆内可见丰富的细胞器，并可见丰富的双层膜结构的自噬小体;模型组可见细胞器减少，胞浆内可见空泡变性，线粒体肿胀，双层膜结构的自噬小体极少。新风胶囊组及氨基葡萄糖组细胞形态良好，胞浆内可见丰富的细胞器，线粒体及内质网形态尚可，并可见到自噬小体。见图2。

图2 电镜下各组大鼠软骨自噬泡及细胞亚结构表现(×20K)Fig.2 Autophagy and cell substructure under the electron microscope (×20K)

2.2 新风胶囊对KOA 大鼠体质量及关节软骨病理评分的影响 造模前各组大鼠体质量差异均无统计学意义(P ＞0.05)。与正常组比较，氨基葡萄糖组、新风胶囊组给药前1 d 体质量显著下降，关节软骨病理评分显著上升(P ＜0.05 或P ＜0.01)，模型组给药后30 d 体质量明显下降，软骨病理评分明显升高;与模型组比较，新风胶囊组给药30 d后体质量明显升高，软骨病理评分明显降低;氨基葡萄糖组软骨病理评分明显降低(P ＜0.01);与氨基葡萄糖组比较，新风胶囊组给药30 d 后体质量明显升高，软骨病理评分明显降低(P ＜0.01)，见图3，表1。

图3 各组大鼠软骨HE 染色(×200)Fig.3 Cartilage morphological observation of KOA rats (HE staining，×200)

表1 新风胶囊对各组KOA 大鼠体质量及关节软骨病理评分的影响(±s，n=10)Tab.1 The effects of XFC on the body mass and Mankin in KOA rats (±s，n=10)

表1 新风胶囊对各组KOA 大鼠体质量及关节软骨病理评分的影响(±s，n=10)Tab.1 The effects of XFC on the body mass and Mankin in KOA rats (±s，n=10)

注:与正常组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;与模型组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与氨基葡萄糖组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别 体质量/g造模前1 d 给药前1 d 给药后30 d 软骨病理评分正常组 172.00 ±14.21 250.80 ±21.89 318.80 ±31.67 1.14 ±0.40模型组 179.20 ±8.79 229.20 ±13.83 274.80 ±22.07▲ 5.72 ±0.86▲▲氨基葡萄糖组 172.40 ±10.81 211.20 ±13.39▲▲ 294.80 ±15.59 2.94 ±0.42▲▲＊＊新风胶囊组 164.40 ±15.32 212.80 ±13.31▲ 345.60 ±24.88＊＊△△ 2.02 ±0.35▲▲＊＊△△

2.3 新风胶囊对KOA 大鼠免疫球蛋白及细胞因子的影响 与正常组比较，模型组血清IgG1、IgG2α、TNF-α 升高，IL-4 降低，(P ＜0.05 或P ＜0.01);与模型组比较，新风胶囊组IgG1、IgG2α、TNF-α 降低，IL-4 升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，氨基葡萄糖组IL-4 明显升高(P ＜0.01)，TNF-α、IgG1 降低(P ＜0.05 或P ＜0.01);与氨基葡萄糖组比较，新风胶囊组给药30 d 后，IL-4 升高(P ＜0.01)，见表2。

表2 新风胶囊对KOA 大鼠外周血免疫球蛋白细胞因子的影响(±s，n=10)Tab.2 Effects of XFC on the IgG and cytokines in KOA rats (±s，n=10)

表2 新风胶囊对KOA 大鼠外周血免疫球蛋白细胞因子的影响(±s，n=10)Tab.2 Effects of XFC on the IgG and cytokines in KOA rats (±s，n=10)

注:与正常组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;与模型组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与氨基葡萄糖组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别 IL-4/(pg·mL -1) TNF-α/(ng·L -1) IgG1/(μg·mL -1) IgG2α/(μg·mL -1)正常组 166.84 ±17.34 207.46 ±15.28 115.85 ±10.83 44.67 ±6.94模型组 31.85 ±1.75▲▲ 252.56 ±11.59▲▲ 148.28 ±14.35▲▲ 55.46 ±8.66▲氨基葡萄糖组 58.52 ±13.57▲▲＊＊ 207.92 ±10.19* 125.19 ±18.03* 50.14 ±13.44新风胶囊组 121.98 ±14.43▲▲＊＊△△ 208.67 ±37.98* 127.9 ±9.8* 37.96 ±9.14＊＊

2.4 新风胶囊对KOA 大鼠软骨、胸腺、脾脏Atg的影响 与正常组比较，在胸腺、脾脏、软骨等各组织中，模型组Atg 存在不同程度的降低(P ＜0.05 或P ＜0.01);与模型组比较，氨基葡萄糖软骨Atg5、Atg7，脾脏Atg12，胸腺中Atg7、Atg12存在不同程度升高(P ＜0.01 或P ＜0.05)，新风胶 囊 组 软 骨 Atg5、Atg7、Atg12、脾 脏 Atg5、Atg12，胸腺中Atg7、Atg12 存在不同程度升高(P ＜0.01 或P ＜0.05);与氨基葡萄糖组比较，新风胶囊组给药30 d 后，Atg5、Atg7 在软骨、胸腺中升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，Atg12 在软骨、胸腺、脾脏中均升高(P ＜0.01)，见表3。

表3 新风胶囊对KOA 大鼠软骨、胸腺、脾脏Atg 的影响(±s，n=10)Tab.3 Effects of XFC on the Atg of cartilage，thymus and spleen in KOA rats (±s，n=10)

表3 新风胶囊对KOA 大鼠软骨、胸腺、脾脏Atg 的影响(±s，n=10)Tab.3 Effects of XFC on the Atg of cartilage，thymus and spleen in KOA rats (±s，n=10)

注:与正常组比较，▲P ＜0.05，▲▲P ＜0.01;与模型组比较，* P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与氨基葡萄糖组比较，△P ＜0.05，△△P ＜0.01

组别软骨 胸腺 脾脏Atg5 Atg7 Atg12 Atg5 Atg7 Atg12 Atg5 Atg7 Atg12正常组 0.86±0.21 1.01±0.14 1.01±0.11 1.00±0.02 1.00±0.06 1.00±0.11 1.01±0.18 1.02±0.24 1.00±0.09模型组 0.16±0.01▲▲ 0.46±0.06▲▲ 0.49±0.04▲▲ 0.73±0.05▲▲ 0.56±0.04▲▲ 0.33±0.22▲▲ 0.43±0.05▲▲0.73±0.04▲0.46±0.04▲▲氨基葡萄糖组 0.25±0.08▲▲＊ 0.53±0.08▲▲＊＊ 0.59±0.03▲▲ 0.81±0.08▲▲ 0.71±0.04▲▲＊＊ 0.66±0.24▲▲＊ 0.44±0.09▲▲0.89±0.05 0.75±0.08▲▲＊＊新风胶囊组 0.58±0.33＊△ 0.9±0.05＊＊△ 0.97±0.13＊△△ 0.87±0.07▲△△ 1.03±0.16＊＊△△ 0.91±0.14＊＊△△0.65±0.07＊＊ 0.79±0.13 0.94±0.12＊＊△△

2.5 KOA 大鼠软骨病理评分、免疫球蛋白细胞因子及软骨胸腺脾脏Atg 等指标的相关性分析 相关性分析显示:IL-4 与软骨病理评分、TNF-α、胸腺Atg12 呈负相关，与脾脏Atg5、Atg7 呈正相关;TNF-α 与软骨病理评分呈正相关;IgG1 与软骨病理评分、TNF-α 呈正相关，与IL-4、脾脏Atg7 呈负相关;IgG2α 与软骨病理评分评分、TNF-α、胸腺Atg12 呈正相关，与IL-4 呈负相关，见表4。

3 讨论

本次研究中我们发现在KOA 大鼠的模型中，IgG1、IgG2α、TNF-α 的表达升高，IL-4 及Atg 在胸腺、软骨、脾脏中表达整体呈降低趋势，而新风胶囊组以及氨基葡萄糖组的各组指标趋向正常组，在降低软骨Mankin 评分及升高IL-4 方面，新风胶囊组优于氨基葡萄糖组。说明在骨关节炎中确实存在着体液免疫及自噬的紊乱，而新风胶囊及氨基葡萄糖均可通过对自噬水平及细胞因子的调控，改善软骨代谢。相关性分析显示:IgG1 与Mankin 评分、TNF-α 呈正相关，与IL-4、脾脏Atg7 呈负相关;IgG2α 与Mankin 评分、TNF-α、胸腺Atg12 呈正相关，与IL-4 呈负相关。就组织而言，自噬基因与细胞因子及免疫球蛋白的相关性主要表现在脾脏和胸腺，而与软骨Atg 无相关性。

表4 KOA 大鼠软骨病理评分、免疫球蛋白细胞因子及Atg 等指标的相关性分析Tab.4 Correlation analysis between Mankin scores and levels of IgG、Atg in KOA rat

IgG 是一种糖蛋白，依据其糖链的不同，分为IgG1 ～4 型。IgG2 “双天线”末端都具有半乳糖，主要的抗原为糖蛋白，IgG1 则有一个半乳糖缺失，是蛋白类抗原的抗体的主要成分［11］。IgG 糖链结构的变化在风湿类疾病中的研究集中在类风湿关节炎，以IgG0 的作用较为突出，主要表现为量的增加和对免疫球蛋白Fc 片段结合能力的下降。对于骨关节炎免疫球蛋白的研究目前尚少，而在对免疫球蛋白的相关研究认为，IgG 糖链结构的变化使IgG 自身成为免疫中的异己成分被识别，与抗体结合形成免疫复合物，沉积于关节滑膜、软骨，刺激活化补体，促发一系列的免疫反应，产生多种细胞因子破坏侵蚀关节软骨，刺激骨质的增生［12］。

TNF-α 参与了KOA 的滑膜组织变性、炎症反应和自身免疫应答3 个病理生理过程，其作用地位仅次于IL-1β。TNF-α 通过诱导软骨细胞产生过氧化反应，增加骨、软骨的破坏的同时，还能够激活破骨细胞，促进骨吸收，抑制成骨细胞形成Ⅰ型骨胶原。临床观察［13］也证实KOA 患者的血清及关节滑液中细胞因子水平均明显高于正常水平，其中关节液水平高于血清水平。TNF-α 还具有诱导人体滑液中的成纤维细胞和单核细胞分泌化学吸收蛋白的作用。通过体外培养软骨细胞体系检测到TNF-α可下调KOA 软骨细胞蛋白聚糖mRNA 的表达，而蛋白聚糖是软骨外基质的主要成分之一。前期研究发现，白介素-4 (IL-4)在软骨代谢过程中起重要的软骨保护作用［14］。

自噬在生理状态下保护机体，但是一旦被过分激活，对机体又是一种损伤［15］。自噬在免疫和炎症以及抵抗微生物感染中起着至关重要的作用，其参与到机体免疫中并促进了炎症性疾病的发展［16-17］。自噬是天然免疫的重要部分，细胞免疫的效应细胞可通过分泌细胞因子调节自噬，进而调控获得性免疫应答。自噬的形成依赖于两个泛素样结合系统:Atg12/Atg5、Atg8/LC3。其中Atg12 泛素样蛋白可被Atg7 活化，然后与Atg5 或磷脂酰乙醇胺结合。在细胞内微生物的免疫反应中，TNF-α能激活细胞自噬，IL-4 能抑制细胞自噬，进而控制胞内微生物的传播［18］。而本研究的结果显示IL-4胸腺的Atg12 呈负相关，与脾脏Atg、Atg7 呈正相关。我们思考可能的原因有两方面:首先，骨关节炎模型大鼠本身出现自噬水平的降低，反馈性上升了TNF-α，降低了IL-4，诱导成纤维细胞及单核细胞分泌化学可吸收蛋白，使软骨细胞及基质破坏，蛋白抗原及糖蛋白暴露于免疫系统，刺激了IgG 的释放。另外也可能是微生物的免疫与自身免疫中的体液免疫及细胞免疫处于不同的调控通路，故对自噬水平的调控作用亦不相同。相关性主要表现在胸腺及脾脏，可能是因为这二者为免疫器官，与相关免疫指标关系更为密切。但并不能说明软骨中的自噬与炎症无关，软骨中自噬基因的变化也较为明显，它可能受到更多因素的调控。

新风胶囊主要由黄芪、薏苡仁、雷公藤、蜈蚣等组成。诸药［19］都有不同程度的抗炎镇痛的作用。其中黄芪、薏苡仁益气健脾，能调节雷公藤具有免疫抑制造成的免疫力低下等不良反应。现代药理研究表明［20］，黄芪能够增强巨噬细胞的数量以及吞噬能力。雷公藤能祛风湿、活血通络、消肿止痛，现代药理研究表明，雷公藤具有抗炎镇痛、促进肾上腺合成皮质激素样作用，对免疫系统主要表现为抑制作用，抑制白介素等细胞因子的表达，从而达到治疗效果［21］。

既往的研究表明，中药新风胶囊具有提高SOD，降低MDA，清除氧自由基，减轻氧化应激损伤，降低炎症反应损伤等作用［22］。新风胶囊可能通过上调自噬水平，抑制免疫炎症反应，而达到改善软骨代谢的作用。

骨关节炎一直以来作为一种退行性病变，免疫机制研究较少。而中医及中成药治疗骨关节炎的优势因现代分子证据的支持而无法凸显。我们将对新风胶囊治疗痹症的机制作更深入的研究。

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