复方穿心莲片的薄层鉴别研究

张慧晔， 潘雪峰，2， 徐小飞， 邓乔华， 王德勤*

(1. 广州白云山和记黄埔中药有限公司，广东广州510515;2. 广东药学院中药学院，广东广州510006)

复方穿心莲片为OTC 药，清热解毒，利湿;常用于风热感冒、咽喉疼痛，湿热泄泻;处方由穿心莲、路边青二味药材组成。复方穿心莲片收载于《卫生部药品标准》中药成方制剂第十九册［1］，原标准鉴别项下(1)和(2)分别是为了检验制剂中是否含有穿心莲和路边青，选用的对照化合物或对照药材分别是脱水穿心莲内酯和路边青对照药材。针对路边青的鉴别项，操作时候对无水条件的要求严格，得到的结果中黄色斑点不清晰，不利于观察和鉴别;另外，在《中国药典》2010 年版、2015 年版的编写中，均主张薄层鉴别中不再使用例如“苯”、“三氯甲烷”这样的有毒试剂。因此，本研究对提取方法、展开系统及显色方法进行了新的探索，摈弃了存在于原薄层鉴别方法中不利于操作者安全的试剂“三氯甲烷”，得到了一个安全、便利和专属性强的薄层鉴别方法。

1 仪器与试药

穿心莲内酯(批号110797-200307)、脱水穿心莲内酯(批号110854-201007)、路边青对照药材 (批号121227-200804)，穿心莲对照药材(批号121082-201004)购于中国食品药品检定研究院，新穿心莲内酯(批号120106)，购于上海融禾医药科技有限公司。硅胶G (批号051007)青岛海洋化工厂生产，自制板规格10 mm ×20 mm，厚度0.5 mm;预制板为青岛海洋化工厂生产，规格为10 mm ×20 mm，厚度0.2 ～0.25 mm。其他所用试剂为分析纯。

复方穿心莲片5 批，F2D001、F2D002、F2D003 为广州白云山和记黄埔中药有限公司生产;L11I111、L11K232为广东罗浮山国药股份有限公司生产。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 取复方穿心莲片15 片，除去糖衣，研细，加石油醚30 mL，超声30 min，弃去石油醚液，残渣加入乙酸乙酯30 mL，超声30 min，乙酸乙酯部分浓缩至1 mL，作为供试品溶液。

2.2 对照品及对照药材溶液的制备 取路边青药材10 g，加200 mL 水，超声30 min，滤过，用等体积乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯部分浓缩至2 mL，作为路边青对照品溶液。取穿心莲内酯、新穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的溶液，作为对照品溶液。

2.3 阴性对照药材溶液的制备 穿心莲600 g，照复方穿心莲片的制法，制成不含路边青药材的阴性对照品;路边青1 400 g，照复方穿心莲片的制法，制成不含穿心莲药材的阴性对照品;再照供试品溶液的制备方法，分别制备成不含穿心莲的阴性供试品溶液和不含路边青的阴性供试品溶液。

2.4 薄层层析 参照《中国药典》2010 年版一部附录VIB 薄层色谱法，吸取供试品溶液、对照品与对照药材溶液及阴性溶液各8 μL，分别点样于同一普通硅胶G 薄层板上。以展开剂乙酸乙酯-甲醇(95 ∶5)上行展开，取出，晾干，喷以1% ～2.5%香草醛的60% ～70%硫酸溶液。供试品色谱中，在与穿心莲内酯与脱水穿心莲内酯对照品色谱相应的位置上，显相同的斑点;再用电热吹风机或电热板加热至斑点显色清晰，自然光下观察，在与路边青对照药材色谱相应的位置上，显一个相同斑点，其中的蓝青斑点为路边青主要专属性斑点。环境温度为室温，湿度为70%。见图1。

图1 复方穿心莲片薄层鉴别图谱

3 讨论

薄层色谱法(thin layer chromatography，TLC)是一种常用的微量分离方法，20 世纪50 年代开始得到广泛使用，可用于样品分离和分析［2］。传统TLC 技术由于精密度和重现性均较差，曾被其他快速发展起来的分离分析技术所取代，80 年代后，随着薄层在色谱板、点样技术、展开技术方面的发展，薄层色谱的规范化和仪器化程度大大提高。加之直观、经济、简便的特点，仍然在中药多样品的分析中发挥作用［3］。

常规薄层色谱的固定相为未改性的硅胶、氧化铝、硅藻土、纤维素和聚酰胺等，其中最常用的为硅胶正相色谱，其优点是设备简单，易于操作，成本小;高效薄层色谱(HPTLC)采用更细、更均匀的改性硅胶和纤维素为固定相，对吸附剂进行疏水和亲水改性，可以实现正相和反相薄层色谱分离，提高了色谱的选择性［4］，如棒状薄层色谱(TLC-FID)、加压薄层色谱 (OPLC)、离心薄层色谱(CTLC)、胶束薄层色谱 (M-TLC)［5］、包合薄层色谱(ICC)［6］、二维薄层(2D TLC)［7］等。薄层色谱检测方法根据吸收原理有吸收测定法、荧光测定法和荧光猝灭法，如薄层扫描法［8］;另外薄层色谱法还能与红外光谱［9］、质谱［10］、拉曼光谱［11］等检测方法联用，与生物信息学结合发展为全息薄层色谱鉴别［12］和薄层指纹图谱鉴别［13］，与生理生化结合，出现了薄层生物自显影技术［14］。本实验使用常规的薄层色谱进行鉴别复方穿心莲片。经多批样品试验，该方法主斑点清晰，易于检出，重现性好，可以准确、有效地鉴别出路边青和穿心莲。

3.1 与《卫生部药品标准》中药成方制剂第十九册复方穿心莲片薄层色谱方法相比，修订后的方法增加了薄层鉴别的专属性。现有方法中［1，15-16］，针对路边青的显色斑点为黄色，此点常常为黄色条带，较模糊，经过改变显色试剂的浓度与显色方式，发现喷以1% ～2.5%香草醛的60%～70%硫酸溶液后加热，能较好地对路边青药材中一蓝青色特异斑点进行显色，可见光下观察，斑点清晰，重现性好且不易受潮湿环境影响;另外，本实验改变了原有方法中的显色步骤，可同时鉴别穿心莲和路边青两种药材，在喷了显色剂后，针对穿心莲使用了在不加热的方法，使得穿心莲显色的斑点杂质较少，更能凸显出穿心莲内酯、新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯主斑点的特征性。针对路边青使用了加热方法，使得路边青的鉴别更加有特征性。

3.2 本方法直接用石油醚、乙酸乙酯等有机试剂对药材进行超声萃取，比现有技术方法［1，15-16］更加安全、简便。在对路边青分部萃取中发现，蓝青色特异斑点存在于乙酸乙酯部分和正丁醇部分，在石油醚部分不存在，在正丁醇萃取后余下的部分少量存在，可能是正丁醇萃取不完全的原因造成的。穿心莲内酯，新穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯也同样在穿心莲乙酸乙酯和正丁醇萃取部分中存在。另外，对薄层条件进行摸索中，试验了石油醚-乙酸乙酯-甲醇系统，石油醚-丙酮-甲醇系统，得到的效果均不如乙酸乙酯-甲醇系统的效果好。

3.3 对影响薄层鉴别的主要因素如不同薄层板的比较、展开温度、湿度等进行考察，发现薄层板的种类、温度对分离效果影响都较小;本方法更适合南方湿度较大的环境，在高湿度条件下，原鉴别中针对路边青的黄色斑点很容易晕染，本实验中所述的蓝青色斑点则很清晰;对于湿度较低的环境，本实验中所述的蓝青色斑点比较难以显色，在展开剂中滴加0.2% ～0.4%的水用于展开即可。

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