HPLC-ELSD 法测定生脉饮中麦冬皂苷D

缪菊连， 黄照昌， 王成军， 杨永寿

(1. 大理学院药学与化学学院，云南 大理671000;2. 大理药业，云南 大理671000)

生脉饮原名“生脉散”，出自金元时代名医李东垣所著的《内外伤辨惑论》，由红参100 g、麦冬200 g、五味子100 g 组成，为《中国药典》2010 年版一部“成方制剂和单味制剂”项下收载品种［1］，有益气生津、敛阴止汗之功效［2］，用于治疗气阴两虚、心悸气短、脉微自汗，气血两虚型脱发、失眠等症［3-4］。《中国药典》2010 年版项下对生脉饮质量控制标准是采用人参二醇、人参三醇和麦冬对照药材为对照，对红参、麦冬进行了TLC 鉴别，无成分定量测定项。2011 年10 月国家药品标准颁布的批件号为ZGB201-20 生脉饮药品标准中，只在《中国药典》2010 年版的基础上增加五味子药材TLC 鉴别和五味子醇甲定量测定项目。从文献资料报道来看，主要增加了五味子乙素、五味子醇甲和人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的HPLC 测定［5-10］。麦冬皂苷［11］具有抗心肌缺血、抗心肌梗阻、抗心律失常的作用，影响心肌的生理特性，而在麦冬皂苷中又以麦冬皂苷D 为主。如能对生脉饮中的麦冬皂苷进行测定，将有助于更全面的评价产品的质量。本实验建立HPLC-ELSD 测定麦冬皂苷D 的方法，对全面评价生脉饮的质量提供一定的依据。

1 仪器与试剂

1260 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);2000ES ELSD 检测器(美国奥泰公司);色谱柱(4.6 mm ×250 mm，5.0 μm)，BP2250 电 子 天 平 (Sartorius 公 司)，Cleanert ODS C18小柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司);麦冬皂苷D 对照品(上海源叶生物科技有限公司提供，批号SM0521KA13，纯度98.2%);乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，纯化水(自制);生脉饮自制(批号分别为130501，130502，130503)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取麦冬皂苷D 对照品2.02 mg 置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀即得，质量浓度为404 μg/mL。

2.2 供试品溶液的制备 取红参100 g，麦冬200 g，五味子100 g 粗粉，用65%乙醇浸渍24 h 后渗漉，收集渗漉液4 500 mL，减压浓缩至250 mL，放冷，加水400 mL 稀释，滤过，另加60%糖浆300 mL，用10%氢氧化钠溶液调节pH 值至6.5，加水至1 000 mL，精密量取20 mL 置于分液漏斗中，用水饱和正丁醇萃取4 次，每次30 mL，合并正丁醇液，水浴蒸干，残渣加2 mL 水溶解，上处理好的ODS小柱，控制上样和洗脱过程体积流量为0.7 mL/min，先用20 mL 水冲洗，再用55%甲醇水溶液20 mL 冲洗，最后用65%甲醇水溶液30 mL 冲洗，收集65%甲醇水溶液，水浴蒸干，残渣用甲醇转移至2 mL 量瓶中，定容至刻度，摇匀即得。

2.3 阴性样品溶液的制备 按“2.2”项制备方法制得不含麦冬的阴性样品溶液。

2.4 色谱条件 UItimate XB-C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm，5 μm)，体积流量2.5 mL/min，进样量20 μL，ELSD检测器，气体体积流量2.5 L/min，漂移管温度95 ℃;流动相为乙腈-水(52 ∶48)，进样量为20 μL，结果见图1、2、3。

图1 麦冬皂苷D 对照品HPLC 图

图2 供试品

图3 阴性供试品

2.5 标准曲线与线性范围 配制对照品系列溶液，使麦冬皂苷D 质量浓度分别为5、10、20、40、80 μg/mL，依次进样20 μL，按上述色谱条件依法测量它们的峰面积，以质量浓度的对数(logC)为横坐标X，以峰面积的对数(logA)为纵坐标Y，进行线性回归，得线性方程为:Y =1.024 9X+0.996 8，r=0.999 7，线性范围5 ～80 μg/mL。

2.6 精密度试验 取质量浓度为10 μg/mL 的对照品溶液6 份，分别精密吸取20 μL 注入液相色谱仪进行测定，计算，结 果 分 别 为10.05、10.22、10.22、10.01、9.82、10.18 μg/mL，平均为10.08 μg/mL，RSD 为1.6%。

2.7 稳定性试验 取本品(批号130501)按要求制得的供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24 h 精密吸取20 μL注入液相色谱仪进行测定，计算，结果为10.05、10.03、9.82、10.15、9.96、10.24 μg/mL，平均为10.04 μg/mL，RSD 为1.5%，表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.8 重复性试验 精密量取同一批次的生脉饮(130501)样品6 份，在上述色谱条件下分别进行HPLC 分析，计算麦冬皂苷D 的量，RSD 为1.3%。

2.9 加样回收率试验 精密吸取对照品溶液(质量浓度为404 μg/mL)40、50、60 μL 各3 份，每份精密加入生脉饮10 mL，置于分液漏斗中，按“2.2”项进行样品处理，依法测定，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.10 样品测定 精密量取3 个批号(130501、130502、130503)的生脉饮，配制成供试品溶液，在上述色谱条件下，分别精密吸取对照品溶液10 μL、20 μL 与供试品20 μL，注入液相色谱仪，按外标两点法计算麦冬皂苷D 的量，结果分别为(10.18 ±0.072)μg/mL、 (10.60 ±0.090)μg/mL、(10.43±0.046)μg/mL。

3 讨论

本实验对样品的前处理方法进行了研究，比较了直接蒸干用甲醇定容、高速离心、正丁醇-水液液萃取、固相小柱萃取及大孔吸附树脂除杂5 种方法对样品中杂质的除去及麦冬皂苷D 的影响，结果表明，各种前处理方法均不能充分去除杂质，对麦冬皂苷D 的测定影响较大。而采用正丁醇-水液液萃取结合固相小柱萃取的方法，在除去杂质的同时能将正丁醇部位所含成分全部洗脱下来。实验中用中药材按相同比例制备了红参-五味子(缺麦冬)的样品溶液，按本方法分析，结果显示待测定的组分均不存在明显干扰，见图3。Chang［12］等采用HPLC-MS 对生脉散中活性成分进行分析，检测到生脉散中麦冬活性成分之一麦冬甲基黄烷酮B。王艳慧等［13］采用HPLC-DAD-MS/MS 对不同来源生脉产品质量评价，Zhang 等［14］采用HPLC-MS-MS 对参麦注射液进行分析，麦冬作为产品不可或缺的组成药味，在产品中并没有检出麦冬的成分，可能原因，一是麦冬药材中麦冬皂苷D 的平均含有量约为0.03%［15］，量很低，加之生产过程的损失，导致产品中含有量不高;二是人参、五味子药材的存在对麦冬皂苷D 的检测干扰较大，需进行较为彻底的前处理。

［1］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］. 北京:中国医药科技出版社，2010:653.

［2］ 梁晓艳，梁旭霞，朱杰民. HPLC 测定生脉饮中五味子甲素和五味子乙素的含量［J］. 广西中医学院学报，2010，13(3):48-49.

［3］ 曹 雯，许道龙，范新建，等. 用HPLC-ELSD 法分析生脉饮中人参皂苷Re 的含量［J］. 药学服务与研究，2010，10(3):228-229.

［4］ 王树业，贾彩肖，许云肖. 生脉饮治疗气血两虚型脱发、失眠的疗效观察［J］. 临床合理用药，2011，4(8B):58.

［5］ 黄海欣. ELSD-HPLC 法测定生脉饮中人参皂苷Re、Rgl和Rbl的含量［J］. 中国药师，2010，13(7):1044-1045.

［6］ 刘凤兰，李东升. HPLC 法测定生脉饮中五味子醇甲的含量［J］. 黑龙江医药，2008，21(4):16-17.

［7］ 钱 梅. 生脉饮中五味子乙素和人参皂苷的鉴定分析与质量控制［J］. 时珍国医国药，2013，24(6):1422-1423.

［8］ 冯雪松，王大成，刘雅茹. 高效液相色谱法测定生脉饮中6 种活性成分的含量［J］. 化学与生物工程，2008，25(2):76-78.

［9］ 文惠玲，李曼莎. 生脉饮超微提取液中人参成分的质量标准研究［J］. 中药材，2009，32(8):1309-1311.

［10］ 潘晓丽，董小萍，骆骄阳，等. HPLC 同时测定生脉饮中人参皂苷Rb1、Rg1 的含量［J］. 中药与临床，2010，1(1):28-30.

［11］ 阳美平，吴 皓，尹 莲，等. 麦冬皂苷和多糖类成分的研究进展［J］. 中华中医药学刊，2008，26 (10):2169-2171.

［12］ Chang Y W，Yao H T，Chien D S，et al. High-performance liquid chromatography-electrospray mass spectrometry for the simultaneous determination of multiple active components in Sheng-Mai San，a prescription of traditional Chinese medicine［J］.Phytochem Anal，2008，19(3):258-265.

［13］ 王艳慧，朱丹妮. 基于HPLC-DAD-MS/MS 的不同来源生脉产品质量评价［J］. 中国科技论文，2012，7(3):230-235.

［14］ Zhang Haijiang，Wu Yongjiang，Cheng Yiyu. Analysis of‘SHENMAI’injection by HPLC/MS/MS［J］. J Pharm Biomed Anal，2003，31(1):175-183.

［15］ 俞建平，马月光，邵建峰，等. ELSD-HPLC 法测定浙麦冬、川麦冬中麦冬皂苷D 含量的方法研究［J］. 中药新药与临床药理，2002，13(4):253-255.