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HPLC-ELSD 法测定生脉饮中麦冬皂苷D

2015-01-13缪菊连黄照昌王成军杨永寿

中成药 2015年2期
关键词:生脉正丁醇五味子

缪菊连, 黄照昌, 王成军, 杨永寿

(1. 大理学院药学与化学学院,云南 大理671000;2. 大理药业,云南 大理671000)

生脉饮原名“生脉散”,出自金元时代名医李东垣所著的《内外伤辨惑论》,由红参100 g、麦冬200 g、五味子100 g 组成,为《中国药典》2010 年版一部“成方制剂和单味制剂”项下收载品种[1],有益气生津、敛阴止汗之功效[2],用于治疗气阴两虚、心悸气短、脉微自汗,气血两虚型脱发、失眠等症[3-4]。《中国药典》2010 年版项下对生脉饮质量控制标准是采用人参二醇、人参三醇和麦冬对照药材为对照,对红参、麦冬进行了TLC 鉴别,无成分定量测定项。2011 年10 月国家药品标准颁布的批件号为ZGB201-20 生脉饮药品标准中,只在《中国药典》2010 年版的基础上增加五味子药材TLC 鉴别和五味子醇甲定量测定项目。从文献资料报道来看,主要增加了五味子乙素、五味子醇甲和人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1和人参皂苷Rd的HPLC 测定[5-10]。麦冬皂苷[11]具有抗心肌缺血、抗心肌梗阻、抗心律失常的作用,影响心肌的生理特性,而在麦冬皂苷中又以麦冬皂苷D 为主。如能对生脉饮中的麦冬皂苷进行测定,将有助于更全面的评价产品的质量。本实验建立HPLC-ELSD 测定麦冬皂苷D 的方法,对全面评价生脉饮的质量提供一定的依据。

1 仪器与试剂

1260 高效液相色谱仪(美国Agilent 公司);2000ES ELSD 检测器(美国奥泰公司);色谱柱(4.6 mm ×250 mm,5.0 μm),BP2250 电 子 天 平 (Sartorius 公 司),Cleanert ODS C18小柱(天津博纳艾杰尔科技有限公司);麦冬皂苷D 对照品(上海源叶生物科技有限公司提供,批号SM0521KA13,纯度98.2%);乙腈为色谱纯,其余试剂均为分析纯,纯化水(自制);生脉饮自制(批号分别为130501,130502,130503)。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液的制备 精密称取麦冬皂苷D 对照品2.02 mg 置于5 mL 量瓶中,加甲醇溶解并定容至刻度,摇匀即得,质量浓度为404 μg/mL。

2.2 供试品溶液的制备 取红参100 g,麦冬200 g,五味子100 g 粗粉,用65%乙醇浸渍24 h 后渗漉,收集渗漉液4 500 mL,减压浓缩至250 mL,放冷,加水400 mL 稀释,滤过,另加60%糖浆300 mL,用10%氢氧化钠溶液调节pH 值至6.5,加水至1 000 mL,精密量取20 mL 置于分液漏斗中,用水饱和正丁醇萃取4 次,每次30 mL,合并正丁醇液,水浴蒸干,残渣加2 mL 水溶解,上处理好的ODS小柱,控制上样和洗脱过程体积流量为0.7 mL/min,先用20 mL 水冲洗,再用55%甲醇水溶液20 mL 冲洗,最后用65%甲醇水溶液30 mL 冲洗,收集65%甲醇水溶液,水浴蒸干,残渣用甲醇转移至2 mL 量瓶中,定容至刻度,摇匀即得。

2.3 阴性样品溶液的制备 按“2.2”项制备方法制得不含麦冬的阴性样品溶液。

2.4 色谱条件 UItimate XB-C18色谱柱 (4.6 mm × 250 mm,5 μm),体积流量2.5 mL/min,进样量20 μL,ELSD检测器,气体体积流量2.5 L/min,漂移管温度95 ℃;流动相为乙腈-水(52 ∶48),进样量为20 μL,结果见图1、2、3。

图1 麦冬皂苷D 对照品HPLC 图

图2 供试品

图3 阴性供试品

2.5 标准曲线与线性范围 配制对照品系列溶液,使麦冬皂苷D 质量浓度分别为5、10、20、40、80 μg/mL,依次进样20 μL,按上述色谱条件依法测量它们的峰面积,以质量浓度的对数(logC)为横坐标X,以峰面积的对数(logA)为纵坐标Y,进行线性回归,得线性方程为:Y =1.024 9X+0.996 8,r=0.999 7,线性范围5 ~80 μg/mL。

2.6 精密度试验 取质量浓度为10 μg/mL 的对照品溶液6 份,分别精密吸取20 μL 注入液相色谱仪进行测定,计算,结 果 分 别 为10.05、10.22、10.22、10.01、9.82、10.18 μg/mL,平均为10.08 μg/mL,RSD 为1.6%。

2.7 稳定性试验 取本品(批号130501)按要求制得的供试品溶液分别在0、2、4、8、12、24 h 精密吸取20 μL注入液相色谱仪进行测定,计算,结果为10.05、10.03、9.82、10.15、9.96、10.24 μg/mL,平均为10.04 μg/mL,RSD 为1.5%,表明供试品溶液在24 h 内稳定。

2.8 重复性试验 精密量取同一批次的生脉饮(130501)样品6 份,在上述色谱条件下分别进行HPLC 分析,计算麦冬皂苷D 的量,RSD 为1.3%。

2.9 加样回收率试验 精密吸取对照品溶液(质量浓度为404 μg/mL)40、50、60 μL 各3 份,每份精密加入生脉饮10 mL,置于分液漏斗中,按“2.2”项进行样品处理,依法测定,结果见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.10 样品测定 精密量取3 个批号(130501、130502、130503)的生脉饮,配制成供试品溶液,在上述色谱条件下,分别精密吸取对照品溶液10 μL、20 μL 与供试品20 μL,注入液相色谱仪,按外标两点法计算麦冬皂苷D 的量,结果分别为(10.18 ±0.072)μg/mL、 (10.60 ±0.090)μg/mL、(10.43±0.046)μg/mL。

3 讨论

本实验对样品的前处理方法进行了研究,比较了直接蒸干用甲醇定容、高速离心、正丁醇-水液液萃取、固相小柱萃取及大孔吸附树脂除杂5 种方法对样品中杂质的除去及麦冬皂苷D 的影响,结果表明,各种前处理方法均不能充分去除杂质,对麦冬皂苷D 的测定影响较大。而采用正丁醇-水液液萃取结合固相小柱萃取的方法,在除去杂质的同时能将正丁醇部位所含成分全部洗脱下来。实验中用中药材按相同比例制备了红参-五味子(缺麦冬)的样品溶液,按本方法分析,结果显示待测定的组分均不存在明显干扰,见图3。Chang[12]等采用HPLC-MS 对生脉散中活性成分进行分析,检测到生脉散中麦冬活性成分之一麦冬甲基黄烷酮B。王艳慧等[13]采用HPLC-DAD-MS/MS 对不同来源生脉产品质量评价,Zhang 等[14]采用HPLC-MS-MS 对参麦注射液进行分析,麦冬作为产品不可或缺的组成药味,在产品中并没有检出麦冬的成分,可能原因,一是麦冬药材中麦冬皂苷D 的平均含有量约为0.03%[15],量很低,加之生产过程的损失,导致产品中含有量不高;二是人参、五味子药材的存在对麦冬皂苷D 的检测干扰较大,需进行较为彻底的前处理。

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