芪七连胶囊对自发性高血压大鼠血管保护作用的实验研究

2015-01-13岳桂华赵晓芳

中成药 2015年2期

罗远，岳桂华，赵晓芳，陈壮，叶雲

(1. 广西中医药大学附属瑞康医院，广西南宁530011;2. 广西中医药大学，广西南宁530001;3. 中国人民解放军第303 医院，广西南宁530021)

芪七连胶囊是广西中医药大学附属瑞康医院开发的医院院内制剂，由黄芪、黄连、三七、黄柏、栀子、杜仲、钩藤等七味药组成，具有益气活血解毒之功效。临床上用于由高血压引起的眩晕、烦躁、头痛、胸闷、心悸、手足麻木、乏力等症。前期的临床观察［1-3］发现芪七连胶囊不仅具有降低血压，而且还可以有效改善患者临床症状，改善焦虑抑郁症状，提高生存质量等作用。本研究观察芪七连胶囊保护自发性高血压大鼠(Spontaneously Hypertensive Rats ，SHR)血管的保护作用，为临床进一步应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物取雄性SHR 50 只和正常血压wistar-kyoto (WKY)大鼠10 只，体质量(200 ±10)g，12 周龄，SHR 购自北京维通利华实验动物技术有限公司 (许可证号SCXK (京)2006 ～0009)。WKY 组为正常对照，购自广西医科大学动物实验中心(合格证号SCXK (桂)2006-0003)。

1.2 药品与试剂芪七连胶囊(广西中医药大学附属瑞康医院民族医药研发基地生产，批号2013062101);氯沙坦(杭州默沙东制药有限公司，批号120028);内皮素(ET )试剂盒(产品编号CSB-E06979r)、血管紧张素(AngⅡ)试剂盒(CSB-E04494r) (武汉华美科技有限公司生产);NO 试剂盒 (南京建成生物工程研究所，批号20110916)。逆转录试剂盒和荧光定量PCR 试剂盒(天根试剂公司)，bFGF 正向引物:5’-CACCCTATCCCTTCACAGC-3’，反向引物:5’-CACCTTCCGACCAGCAAC-3’，PCR 产物片段为112 bp。参照基因GAPDH，正向引物:5’-ACCACAGTCCATGCCATCACT -3’，反向引物:5’-TCCACCACCCTGTTGCTGTA -3’，PCR 产物片段为452 bp，以上引物由上海申友公司合成。

1.3 仪器 MK3 酶标仪(美国Thermo 生产);BP-6 型大鼠无创血压测试仪(成都泰盟科技有限公司生产);LKB-V 超薄切片机 (瑞士LKB 公司);H-500 型透射电子显微镜(日本日立公司);PAC-300 低压电泳仪(美国Bio-Rad);PTC 200 多通道PCR 扩增仪(美国MJ);1575 洗板机(美国BIO-RAD 生产)，5810R 型低温高速离心机(德国Eppendorf);凝胶成像分析系统(GELDOC Xr)。

2 实验方法

2.1 药物制备取芪七连胶囊内容物适量，加入蒸馏水制成适宜质量浓度的混悬液(临用摇匀)。

2.2 动物分组及给药将SHR 随机分为模型组，阳性药对照组，芪七连胶囊低、中、高剂量组，每组10 只，另取10 只健康WKY 大鼠作为正常对照。给药剂量为:氯沙坦组(4 mg/kg)，芪七连胶囊3 个剂量(0.3、0.6、1.2g/kg，依据人与大鼠体表面积剂量转换，分别相当于人临床用药的0.5、1、2 倍)、模型对照组、正常对照组灌服等容积蒸馏水。每日1 次，每次给药量为10 mL/kg，连续给药6 周。

2.3 大鼠血压测量每周用BP-6 无创尾动脉血压测量分析系统测量清醒状态下大鼠尾动脉血压。

2.4 样品采集与检测给药6 周后，上述各组动物以戊巴比妥30 mg/kg 腹腔注射麻醉，迅速从腹主总动脉取血，并剪取腹主动脉。血浆4 ℃离心(4 000 r/min)10 min，取上清液，置-20 ℃保存。腹主动脉分3 份，一份迅速置于1.5 mL 离心管中加入Trizol 1 mL，-80 ℃保存;一份放入预冷的2.5%戊二醛固定备用，另外一份置于10%的福尔马林中固定。全部取样结束后，用放免法检测血清中NO、ET-1 和AngⅡ水平，均严格按各试剂说明书操作。

2.5 主动脉病理观察及评分标准取经10%福尔马林固定的主动脉，脱水，常规石蜡包埋，切片(4 μm)，HE 常规染色。光镜下对每张切片全视野观察病理变化并评分，观察动脉血管内皮细胞层损伤、中膜损伤、外膜增生3 个指标，分为正常、轻度、中度、重度4 个等级，每个等级的评分分别为0、1、2、3 分。

2.6 血管内皮细胞病变情况取经2.5%戊二醛固定的腹主动脉，后用PBS 漂洗3 次，再放入1%锇酸固定2 h，再用PBS 漂洗3 次，经过脱水，环氧树脂包埋，切片，醋酸铀-枸橼酸铅双染色，透射电子显微镜下观察血管内皮细胞超微结构病理变化情况。

2.7 PCR 法检测bFGF mRNA 表达取Trizol 液中保存的腹主动脉，按试剂盒说明进行样品总RNA的提取与纯化，以PCR 仪逆转录后，RT-PCR 仪进行扩增，按照下列反应条件进行:预变性94 ℃5 min;94 ℃变性50 s，56 ℃退火50 s，72 ℃延伸30 s，进行35 个循环，72 ℃延伸10 min，2% 琼脂糖凝胶电泳，溴乙锭显色。扩增产物条带用凝胶成像分析系统图像分析软件作光密度测定，用目的基因条带与GAPDH 条带光密度的比值作为目的基因mRNA 的相对水平。

2.8 统计学处理应用SPSS 17.0 统计软件分析处理数据，所有数据以均数±标准差(±s)表示，两组数据间的比较采用t 检验，动脉病变评分采用Mann-whitney 秩和检验，P ＜0.05 为有显著统计学差异。

3 结果

3.1 对SHR 血压的影响与治疗前比较，给药后6 周，芪七连胶囊高、中、低剂量组均对SHR 的收缩压(SP)和舒张压血压(DP)均明显降低(P ＜0.05 ～0.01)，氯沙坦组在治疗后对SP 和DP也有显著的降低作用(P ＜0 .01);与氯沙坦组比较，芪七连胶囊组无优效性，见表1。

表1 芪七连胶囊对SHR 血压的影响(1 mmHg =0.133 kPa，±s，n=10)Tab.1 Effects of Qiqilian Capsules on blood pressure of SHR (1 mmHg=0.133 kPa，±s，n=10)

注:与治疗前比较，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.01;与模型对照组比较，＊＊P ＜0.01，* P ＜0.05

组别剂量治疗前/mmHg 治疗6 周后/mmHg正常对照组模型对照组——氯沙坦组4 mg·kg -1芪七连胶囊组0.3 g·kg -1 0.6 g·kg -1 1.2 g·kg -1 SP 109.83 ±7.26 107.12 ±6.42 DP 78.64 ±5.50 79.02 ±3.46 SP 157.05 ±9.44 188.33 ±13.70▲▲DP 114.71 ±6.18 134.60 ±9.53▲▲SP 155.34 ±11.12 117.95 ±7.43▲▲＊＊DP 115.21 ±7.59 83.39 ±5.09▲▲＊＊SP 156.01 ±11.97 124.19 ±9.15▲▲＊＊DP 115.26 ±7.04 96.92 ±7.53▲＊＊SP 156.87 ±11.36 119.04 ±8.75▲▲＊＊DP 114.05 ±6.65 89.44 ±4.26▲▲＊＊SP 154.23 ±10.77 119.31 ±7.61▲▲＊＊DP 114.82 ±7.02 86.16 ±6.57▲▲＊＊

3.2 芪七连胶囊对SHR 血清中NO、ET、AngⅡ水平的影响与正常对照组比较，模型对照组SHR 血浆ET、AngⅡ水平较正常对照组组明显升高(P ＜0.01)，NO 水平较正常对照组明显降低(P ＜0.01)。芪七连胶囊各治疗组对SHR 血浆ET和AngⅡ水平较模型对照组有所降低，NO 水平有所升高(P ＜0.05 或P ＜0.01)，见表2。

表2 芪七连胶囊对SHR 血清中ET、Ang Ⅱ、NO 水平的影响(±s，n=10)Tab.2 Effects of Qiqilian Capsules on ET，Ang Ⅱ，NO in serum with SHR (±s，n=10)

注:与正常对照组比较，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.01;与模型对照组比较，＊＊P ＜0.01，* P ＜0.05

组别剂量 ET/(pg·mL -1) AngⅡ/(pg·mL -1) NO/(μmol·L -1)46.32 ±9.45 437.08 ±37.11 107.37 ±20.41模型对照组 — 83.15 ±17.33▲▲ 771.12 ±48.59▲▲ 38.83 ±8.14▲▲氯沙坦组 4 mg·kg -1 48.71 ±11.35＊＊ 499.19 ±23.41▲＊＊ 80.57 ±14.02▲▲＊＊芪七连胶囊组 0.3 g·kg -1 67.02 ±11.80▲▲＊＊ 631.16 ±39.07▲▲＊＊ 56.56 ±19.64▲▲＊＊芪七连胶囊组 0.6 g·kg -1 54.15 ±12.85▲＊＊ 581.42 ±41.26▲▲＊＊ 74.57 ±14.67▲▲＊＊芪七连胶囊组 1.2 g·kg -1 50.66 ±14.02＊＊ 522.23 ±38.38▲＊＊ 86.07 ±17.69▲＊＊正常对照组 —

3.3 对主动脉组织病变的影响与模型对照组比较，各治疗组能有效的改善动脉组织的病变情况，芪七连胶囊低、中、高剂量组能有效改善动脉内皮细胞层、中膜层损伤及外膜层增生情况(P ＜0.01或P ＜0.05)，并在给药量0.3 ～1.2 g/kg 呈量-效关系，见表3。

3.4 对主动脉血管内皮细胞超微结构病理的变化的影响在透射电镜下观察，正常对照组血管内皮细胞肌膜清晰，细胞内可见大量密斑，细胞核形态较规则，线粒体形态正常，胞浆内可见少量内质网(见图1-A);模型对照组血管内皮细胞明显肿胀，膜大多尚完整，胞内可见大量密斑、密体，细胞核不规则，线粒体空泡变(见图1-B);氯沙坦组可见肌膜清晰，细胞核较规则，线粒体形态正常(见图1-C);芪七连胶囊低剂量组胞内可见大量密斑、密体，细胞核较规则，线粒体肿胀、胞内出现大量空泡(见图1-D);芪七连胶囊中剂量组膜较完整，细胞核较规则，线粒体形态多数规则(见图1-E);芪七连胶囊高剂量组部分血管内皮细胞轻度肿胀，细胞排列整齐，膜完整，多突起，胞膜下密斑清晰可见，细胞核形态较规则，线粒体结构正常(见图1-F)。

表3 芪七连胶囊对SHR 主动脉组织病变的的影响(±s，n=10)Tab.3 Effects of Qiqilian Capsules on pathological changes in aortic wall with SHR (±s，n=10)

注:与正常对照组比较，▲▲P ＜0.01，▲P ＜0.01;与模型对照组比较，＊＊P ＜0.01，* P ＜0.05

组别剂量内皮细胞层损伤中膜层损伤外膜层增生正常对照组 —0.00±0.00 0.00±0.00 0.00±0.00模型对照组 — 2.78±0.43▲▲ 2.13±0.35▲▲ 1.62±0.26▲▲氯沙坦组 4 mg·kg -1 0.99±0.22＊＊ 0.79±0.17＊＊ 0.34±0.11＊＊芪七连胶囊组0.3 g·kg -1 1.30±0.31▲* 1.13±0.40▲* 0.46±0.09*芪七连胶囊组0.6 g·kg -1 0.97±0.27▲＊＊ 0.70±0.33＊＊ 0.35±0.13＊＊芪七连胶囊组1.2 g·kg -1 0.67±0.16＊＊ 0.44±0.24＊＊ 0.30±0.16＊＊

图1 芪七连胶囊对SHR 主动脉超微结构的影响(×4800)Fig.1 Effects of Qiqilian Capsules on aortic Ultrastructures features in SHR

3.5 RT-PCR 半定量检测bFGF mRNA 的表达与模型对照组相比，芪七连胶囊各治疗组、氯沙坦组中SHR 主动脉血管中的bFGF mRNA 的相对表达量不同程度的降低，有显著性差异(P ＜0.01)，表明芪七连胶囊可以有效的抑制动脉血管中bFGF 的表达;与氯沙坦组比较，芪七连胶囊组无优效性。见表4，图2。

表4 芪七连胶囊对SHR 动脉中bFGF mRNA 表达量的影响Tab.4 Effects of Qiqilian Capsules on mRNA expression of aortic bFGF in SHR

图2 bFGF mRNA 电泳图像Fig.2 Image of different bFGF mRNA expression levels

4 讨论

血管内皮是血管壁和血液之间的屏障，具有维持血管壁的光滑和血流通畅，介导炎症与免疫反应，参与调节抗凝系统，调节血管平滑肌细胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)的生长及增殖等功能。血管内皮功能障碍被认为是高血压的病因，其功能混乱是高血压病始动环节和早期表现的重要特征［4］，大量的研究表明，高血压患者几乎都伴随着血管内皮功能的减退，血管内皮损伤的程度可以反映出高血压患者病情的严重程度［5-7］，因此，阻止或逆转高血压患者血管内皮病变是防治高血压病情发展的关键。光镜和电镜观察动脉组织的病变情况，可以直观的反应芪七连胶囊保护SHR的血管内皮作用。本实验通过光镜和电镜观察芪七连胶囊对SHR 的动脉血管组织的的病变情况。采用秩和检验法比较各组间SHR 动脉血管组织的情况，与模型组比较，芪七连胶囊能明显改善SHR主动脉内皮细胞部分脱落，内膜不光滑，有血细胞黏附聚集，中膜弹性纤维变直、减少、断裂，外膜增生等情况。通过电镜观察血管内皮细胞，结果表明芪七连胶囊能够能够明显改善内皮细胞肿胀，细胞核不规则，线粒体空泡变等病理情况，表明芪七连胶囊具有保护血管的作用。

血管内皮对高血压病的影响主要是通过分泌多种血管活性物质，达到调节血管壁的舒缩和平滑肌细胞的增殖、迁移等作用，这些活性物质主要包括NO、ET、AngⅡ、前列环素等。NO 是内皮细胞释放的主要舒血管物质，它的生成和分泌的正常是血管内皮功能正常的重要标志，它不仅维持血管张力的恒定和调节血压的稳定，还通过抑制细胞有丝分裂VSMC 的增殖和迁移，参与血管重塑，一旦NO合成和利用发生障碍，血管内皮长期处于促炎症、促血栓和促凝状态，进而导致血管结构的改变和血管平滑肌的肥大。AngⅡ血管内皮细胞分泌细胞因子，它可促使血管平滑肌发生剧烈收缩，进而引起血管外周阻力增加和动脉压升高。同时，AngⅡ还可以作用于交感神经末梢上及中枢神经系统的血管紧张素受体，释放去甲肾上腺素及加强交感缩血管紧张使外周阻力增大，血压升高。因此，抑制AngⅡ活性是治疗高血压及逆转血管重构的基础。此外，局部组织产生的AngⅡ可以促进血管ET-1的合成和分泌，又可以抑制NO 的合成和分泌，而AngⅡ与NO 之间的活性不平衡是诸多疾病发生的根源。ET 是由血管内皮分泌的缩血管多肽，是目前已知缩血管作用最强最持久的细胞因子，同时，ET 可以促进c-myc、c-fos 等原癌基因表达，使得血管内皮细胞增殖，血管壁增厚、管腔变得狭窄［8，9］。当血管内皮损伤时，血管内皮ET 表达增强，ET 水平升高。因此，测定血浆中 NO、AngⅡ、ET 水平能够可靠地反映血管内皮的功能状态和损伤程度［10-12］，有效的反应芪七连胶囊对SHR 血管内皮保护作用的部分机制。本实验结果显示，芪七连胶囊可以抑制Ang Ⅱ、ET 的活性(P ＜0.01 或P ＜0.05)，上调NO 的的活性(P ＜0.01)，这是可能芪七连胶囊降血压的部分机制之一，也可能是其保护血管作用的部分机制。

在高血压的发生发展中，很多生长因子的异常分泌都会引起VSMC 的表型转换、增殖及迁移，而bFGF 作为VSMC 的最强的有丝分裂原，其作用更是尤为突出。正常情况下合成bFGF 的主要血管壁细胞包括VSMC 和内皮细胞，但内皮细胞受损，浸润的巨噬细胞和T 淋巴细胞也能合成bFGF。因此，血管内皮受损，将会导致bFGF 的异常表达［13-15］。此外，bFGF 可诱导血管壁NO 合酶的活性，促进NO 的产生，舒张血管，从而对血压进行调节，拮抗高血压的形成。因此，测定bFGF 的表达量，可以直接反应药物对高血压病情的改善程度。本实验结果显示，芪七连胶囊有效的抑制SHR 动脉血管中bFGF 的表达(P ＜0.01)。

综上所述，芪七连胶囊对SHR 血管具有较好降血压及血管保护作用，其作用的机制可能是通过下调血清中ET、AngⅡ的活性，增强血清中NO 的活性，下调动脉血管中bFGF mRNA 的的表达有关，其是否通过其他的途径，还需进一步的研究。

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