维生素B6联用20AA复方氨基酸治疗创伤性凝血病的疗效及机制研究

楚鹰 岳茂兴 包卿 郑旭文 沈文明 刘政 周培根

李瑛1 卞晓星1 黄琴梅1 尹进南1 梁华平2

创伤性凝血病(trauma-induced coagulopathy, TIC)是世界性的治疗难题，主要表现为严重创伤或大手术打击下，机体出现的凝血障碍或紊乱[1]。创伤后早期死亡与无法控制的出血以及创伤失血后凝血病有关，特别是严重创伤患者出现凝血病，死亡率更高，可以达到80%左右[2]。TIC的发病机制尚未完全阐明。最新的观点认为，TIC是由创伤导致的组织损伤和低灌注引发，活化蛋白C介导其发生发展，凝血系统各组分和因素参与其病理生理反应过程。而传统观点中的低温、酸中毒、血液稀释，炎症反应等因素，进一步恶化了已存在的凝血功能障碍，最终导致创伤相关的凝血功能障碍[3- 4]。目前对于TIC的救治主要采用损伤控制性外科与复苏、成分输血、凝血因子制品、止血药物及目标导向输血方案等。笔者在综合治疗的基础上，采用20AA复方氨基酸联用大剂量维生素B6新疗法救治创伤性凝血功能障碍及TIC取得了比较好的效果，是救治凝血功能障碍及TIC的一种简便实用、经济、有效的创新性疗法[5]。因此，本研究通过建立大鼠创伤性凝血功能障碍模型，采用血栓弹力图分析仪与传统凝血功能检测等手段，探索20AA复方氨基酸联用大剂量维生素B6新疗法对创伤性凝血功能障碍大鼠的治疗效果，最后利用实时荧光定量PCR技术分析由肝脏所合成的凝血因子的基因表达水平，探索新疗法的可能作用机制。

材料与方法

一、实验材料

1.试剂和仪器：试剂包括维生素B6注射液(0.1 g/支，2 mL)，石药集团欧意药业有限公司(批号073121002)。20 AA复方氨基酸注射液(丰诺安注射液，50 g总氨基酸500 mL，辰欣药业股份有限公司，批号1311082164)。复方氯化钠注射液(0.9%等渗盐水，四川科伦药业股份有限公司，批号B13092607)，ReverTra Ace®qPCR RT Kit(日本TOYOBO公司)，TRIzol®Reagent(美国Life Technologies公司)，Select Master Mix Q-PCR kit(美国Life Technologies公司)，PCR引物合成(上海捷瑞生物工程有限公司)。仪器包括TEG 5000血栓弹力图仪(美国Haemoscope公司)，CA-1500自动凝血分析仪(日本SYSMEX公司)，WZS-50F2微量注射泵(浙江浙大医学仪器有限公司)，ABI 7500 实时荧光定量PCR(美国Life Technologies公司)，高速冷冻离心机(中科中佳科学仪器有限公司)，分光光度计(上海美谱达仪器公司)，Mupid-One核酸电泳系统(日本Takara公司)，Gel-Doc凝胶成像系统(美国Bio-Rad公司)。

2.实验动物及分组：雄性SD大鼠114只，体重170～200 g，江苏大学实验动物中心提供，动物许可证号：SCXK(苏)2013-0011。TIC大鼠模型建立实验按随机原则分为假手术组 (10只)，模型组(50只)，分别于造模后4 h，6 h，12 h，24 h和48 h时间点采集标本，每个时间点10只；新疗法疗效实验分为假手术组，等渗盐水对照组，20AA复方氨基酸与维生素B6联合治疗组，共3组，每组8只；新疗法作用机制实验分为正常组(3只)、假手术组(3只)、新疗法组(12只)、对照组(12只)，新疗法组与对照组分别在伤后4 h，6 h，12 h及24 h四个时间点采集标本，每个时间点3只。

二、方法

1.大鼠TIC模型的建立：实验采用Feeney’s自由落体硬膜外撞击法建立TBI模型，大鼠适应性喂食3 d，禁食8 h，禁水2 h，称重后用新鲜配置的10%水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射麻醉。麻醉后将大鼠背侧固定，头部备皮消毒后剪开头皮，剥离骨膜，麻花钻于矢状缝右侧2 mm，冠状缝后4 mm处钻直径5 mm的圆形窗，硬脑膜保持完整。使用自由落体打击器用40 g砝码于25 cm处落下造成重度损伤，打击力为1 000 g·cm。造模后缝合头皮。指触确定大鼠股骨位置，皮肤开口1～2 cm，暴露股骨肌肉，钝性分离肌肉与股骨后，剪断股骨，造成双腿股骨骨折，缝合伤口。将大鼠翻转固定，沿腹中线剪开皮肤，开腹造成5 cm创口。将内脏推至一侧后，剥离出腹主动脉，注射器抽血 2 mL(约占总血量的20%)，按压止血后，缝合腹部伤口。

2.治疗干预：模型制作完毕后，新疗法治疗组和等渗盐水组大鼠，仰卧位固定，颈部切开，钝性分离结缔组织和肌肉，暴露颈静脉，分离并插入PE-50管，固管缝合伤口后，连接微量输液泵，输液速度为4 mL/h。新疗法治疗组混合输注丰诺安10 mL+维生素B64 mL(相当于人体剂量：丰诺安500 mL+维生素B610 g)，等渗盐水组输注0.9%等渗盐水 14 mL。假手术组大鼠，备皮消毒，颈静脉插管后，不进行输液操作。

3.标本采集和检测：造模后，使用2.5 mL注射器于腹主动脉采集血液标本，针管预先吸取0.25 mL 3.2%枸橼酸钠盐，抽血2.25 mL后，迅速将血样注入BD蓝盖采血管中，轻轻颠倒5～10次混匀血样。取1 mL全血标本送武进医院检验科检测血栓弹力图TEG，剩余血样以3 000 r/min离心3 min，收集血浆送武进医院检验科检测凝血4项指标。

4.TEG参数与凝血四项指标：反应时间(R)反映凝血因子活性，血块生成时间(K)反映纤维蛋白交联情况、血块生成率(Angle)反映整体血块形成的速率，与纤维蛋白原浓度与血小板功能状态相关，最大宽度值(MA)反映血块的最大强度，主要反映血小板的功能，也能反映纤维蛋白原水平。凝血酶原时间(PT)主要反映外源性凝血系统状况，活化部分凝血活酶时间(APTT)主要反映内源性凝血系统状况，纤维蛋白原(FIB)主要反映纤维蛋白原的含量，凝血酶时间(TT)主要反映纤维蛋白原转化为纤维蛋白的时间。

5.RNA提取与定量PCR反应：(1)总RNA提取：提取RNA所用的耗材均为无RNA酶制品，玻璃器皿常规洗净后，180℃烘烤6 h。所有试剂均用0.1%DEPC水配制。样品匀浆化处理：剪切新鲜肝脏组织后迅速液氮冷冻保存，提取总RNA时取50～100 mg组织块，加入1 mL TRIzol，玻璃匀浆管研磨，室温静置5 min后，匀浆液4℃， 以12 000 r/min离心10 min后取上清；加入0.2 mL氯仿，剧烈震荡15 s，室温放置3 min；4℃，12 000 g离心15 min后取上层水相，加入0.5 mL异丙醇，室温放置10 min；4℃， 12 000 g离心10 min后，移去上清，加入1 mL 75 %乙醇洗涤RNA沉淀；4℃， 7 600 g离心5 min,移去上清。空气中干燥RNA沉淀10 min；加入50 μL 0.1%DEPC水，55℃放置10 min溶解RNA。RNA纯度检测及定量：取适量RNA稀释后，分光光度计测定A260和A280，计算RNA浓度，琼脂糖电泳鉴定其完整性。(2)定量PCR反应：RNA的逆转录：按ReverTra Ace qPCR RT kit说明书体系进行逆转录，合成cDNA；定量PCR反应： 使用SYBR Select Master Mix进行real-time PCR，反应在ABI 7 500上进行。qPCR引物设计采用NCBI提供的Primer-BLAST工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)，引物序列见表1，反应条件为50℃ 2 min,95℃ 2 min(95℃ 15、55℃ 15、 72℃ 30)，40个循环。为确定扩增特异性，PCR产物均进行溶解曲线分析并进行琼脂糖凝胶电泳。mRNA的表达水平利用2-ΔΔCt进行计算，利用管家基因GAPDH进行标准化。

三、统计学分析

结 果

一、大鼠TIC动物模型的建立

本模型通过造成大鼠颅脑损伤、双股骨骨折，开腹及腹主动脉放血，制成大鼠多发伤模型(图1)。伤后4 h R值降低，12 h开始升高，但与正常组相比较无统计学意义，48 h达到高峰，24 h，48 h与正常组比较具有统计学差异(P<0. 05)，K值和Angle各组变化不大，与正常组相比较无统计学意义；MA 4 h开始延长，48 h达到高峰，24 h、48 h与正常组比

较具有显著统计学差异(P<0. 01)。见表2。

二、新疗法对模型大鼠凝血功能的影响

选择造模后24 h作为检测模型凝血功能变化的时间点，TEG结果显示新疗法组R值为(2.24±0.68) min，显著低于模型组的(3.21±0.30) min(P<0.05)；新疗法组Angle值(81.98±1.78)°显著高于模型组的(79.54±2.13)°(P<0.05)。而K值与MA值，新疗法组与模型组差异无统计学意义(P>0.05)。见表3。

传统凝血功能试验，其结果与TEG结果具有相同的变化趋势，具体反映在新疗法治疗组与模型组相比：凝血酶原时间、活化部分凝血活酶时间，凝血酶时间均缩短，而纤维蛋白原值提高，但统计学分析结果表明差异不显著(P>0.05)。见表4。

表1 定量 PCR引物序列

图1 大鼠创伤性凝血病动物模型制作。A、B.大鼠颅脑损伤操作；C.为大鼠颈静脉置管；D.大鼠开腹；E.大鼠股骨骨折；F.大鼠颈静脉输液

组别鼠数R(min)K(min)Angle(deg)MA(mm)正常组102.20±0.600.80±0.0079.73±1.2170.40±4.004h101.83±0.410.80±0.0081.75±3.2976.73±2.336h101.90±0.360.80±0.0080.57±1.9072.63±3.0612h102.58±0.480.80±0.0080.98±1.4380.08±2.5524h103.10±0.20a0.80±0.0080.40±1.8984.03±1.93b48h103.40±0.58a0.80±0.0080.50±1.2484.58±2.10bF值4.7740.6861.0472.194P值0.030.670.3780.001

与正常组比较：aP<0.05，bP<0.01

表3 正常对照组、模型组与新疗法组TEG结果比较

注：R为反应时间，K为血块生成时间，Angle为血块生成率，MA为最大宽度值。与正常对照组比较:aP<0.05;与模型组比较;bP<0.05

表4 正常对照组、模型组与新疗法组凝血4项结果比较

注：PT为凝血酶原时间，APTT为活化部分凝血活酶时间，FIB为纤维蛋白原，TT为凝血酶时间。新疗法组、模型组分别与正常对照组比较：P>0.05

三、新疗法对大鼠模型凝血因子基因表达的影响

1.组织提取总RNA电泳鉴定：采用琼脂糖凝胶电泳鉴定总RNA的完整性及纯度(见图2)。电泳结果显示明显的5 s、18 s和28 s条带，且28 s条带的亮度大约是18 s条带的两倍，说明提取的总RNA基本没有降解。紫外分光光度计对RNA样品进行分析的结果显示A260/A280比值在1.8～1.9之间，表明RNA具有较高纯度，满足逆转录合成cDNA的要求。

2.凝血因子基因mRNA在肝脏组织中的表达：为验证凝血因子基因在肝脏中的表达情况，我们利用正常大鼠的肝脏cDNA作为模板，检测7条在肝脏中合成的凝血因子基因的表达(见图3)。所有引物对均能检测到预期长度的PCR产物，没有非特异扩增条带的出现。溶解曲线分析的结果也是单一峰图，与PCR产物电泳结果一致(结果未显示)。说明所设计的PCR引物能够用于凝血因子基因的定量检测，且所有7条基因均在肝脏细胞中表达。

图2肝脏组织总RNA电泳结果。注：M. DNA分子量标准品；1.正常组；2.假手术组；3.新疗法组；4.对照组

图3凝血因子基因定量PCR扩增结果。注：M.DNA分子量标准品；1.FⅡ；2.FⅦ；3.FⅨ；4.FⅩ；5.FⅪ；6.FⅫ；7.FⅩⅢA；8.GAPDH

3.大鼠模型凝血因子mRNA表达变化：采用定量PCR对所有处理组的凝血因子基因表达水平进行了检测，结果发现，与正常组和假手术组相比，新疗法组与对照组的凝血因子基因表达明显上调，伤后 4 h时间点基因表达上调倍率最大，随后随时间延长，其表达量逐渐降低。新疗法组与对照组相比，凝血因子基因表达水平明显更高，其差异具有统计学意义(P<0.05)。本研究还发现在所有检测的凝血因子基因中，FⅨ上调倍率最大，而FⅪ与FⅩⅢA亚基上调倍率较小。

图4凝血因子基因mRNA相对表达变化 注：分别为凝血因子FⅡ，FⅧ，FⅨ，FⅩ，FⅪ，FⅫ，FⅩⅢA亚基;与对照组比较，aP<0.05

讨 论

创伤是全球范围内中青年致死、致残的首要原因[6]，40%的创伤致死患者是由出血导致[7]，约1/4 患者入院时即有急性TIC，病死率是非TIC 患者的4～6倍[8-9]。及早预防与纠正凝血病有利于改善创伤患者预后。以损失控制外科与目标导向止血复苏为主的救治方法能明显改善创伤患者的凝血功能，降低病死率，但需大量输入血液制品或重组凝血因子，同时新鲜血浆、浓缩红细胞和血小板的最佳比例，以及重组FⅦ a与纤维蛋白原或冷沉淀的应用指征等仍有争议[4]。因此，探索TIC 的新疗法具有重要意义。

笔者之前的研究发现，20AA 复方氨基酸联合大剂量维生素B6也能够救治TIC。该疗法简便易行，费用低廉，是国内外首创的治疗方法。20AA复方氨基酸与人体氨基酸谱基本一致，输入后即可为机体提供底物，其含有的L- 鸟氨酸是尿素循环的中间代谢物，能迅速激活肝细胞内的尿素循环，将机体产生的有害CO2和氨通过尿素循环转化为尿素排出体外，并能有效清除多器官功能障碍综合征(MODS)时产生的大量有害自由基，从而减少自由基对器官的毒害，恢复肝功能正常代谢[10]。维生素B6在人体代谢中主要以磷酸吡多醛形式参与近60 多种酶反应，多数与氨基酸代谢有关，包括转氨基、脱羧、侧链裂解、脱水及转硫化作用[11]。20AA 复方氨基酰联合维生素B6能促进肝内酶代谢体系快速恢复，产生重要凝血因子，迅速恢复内源性凝血途径，同时配合常规治疗，能有效治疗凝血病大出血的濒死患者。

传统的凝血4 项指标通常只能反映凝血早期的状态，不能反映整个凝血过程。TEG 是基于全血的凝血功能检测方法，其检测时间短，能监测凝血全过程，全面反映凝血因子、纤维蛋白活性以及血小板功能的变化，有助于早期诊断凝血功能障碍，是目前测定凝血功能的“金标准”之一[12-13]。本研究在TIC 动物模型的基础上，分别用TEG 和凝血4 项检测新疗法对大鼠凝血功能的影响，结果提示，新疗法可能通过提高凝血因子活性、改善FIB 水平以提高凝血功能。尽管新疗法组与模型组凝血4 项结果不存在统计学差异，但新疗法组各项指标均有改善，与TEG 结果具有相同的变化趋势。本实验中凝血4 项检测所用的试剂盒是针对人凝血功能检测的，有可能无法准确监测大鼠凝血功能的改变，这也是未检测到有统计学差异的原因之一。大鼠创伤后FIB 值升高与TEG 检测的Angle 值变化一致，但TEG 结果与凝血4 项结果是否具有相关性，还需要进一步的实验验证。另外，FIB 在创伤过程中可受炎性因子的调控升高，这也是正常的生理现象。这些结果说明我们制备的TIC 大鼠模型可能只反映了凝血因子丢失或活性下降的特征，而血小板功能下降或纤溶亢进等特征未能得到很好的复制，所以有些TEG 参数在模型组和正常对照组之间未出现统计学差异。

血液凝固是一系列复杂的级联酶促反应过程，需要多种凝血因子的参与。目前已发现的凝血因子主要有14种，其中根据发现的先后顺序用罗马数字编号命名的有12种，为凝血因子Ⅰ-ⅩⅢ。这些凝血因子除FⅣ是Ca2+外，其余均为蛋白质，且大多数在肝脏内合成，因此肝脏是影响凝血功能的重要器官[14]。在本研究中，笔者发现7个在肝脏中合成的凝血因子基因，除FⅪ和FⅩⅢ A亚基外，其余均在模型致伤后4 h出现不同程度的mRNA表达上调，随后上调水平逐渐下降。该结果验证了之前所观察到的模型先出现高凝状态，后凝血功能持续降低的现象。而采用复合氨基酸联用维生素B6疗法的处理组，其凝血因子基因mRNA上调水平显著高于对照组，其表达水平变化随伤后时间延长而降低，但仍维持在较高的水平。这说明复合氨基酸联用维生素B6疗法能够刺激大鼠模型凝血因子基因的表达，促进凝血因子在肝脏中的合成，从而改善其凝血功能。

总之，本研究通过建立与临床基本相符的大鼠TIC模型，验证了维生素B6联用20AA复方氨基酸疗法对TIC大鼠凝血功能的改善作用，并发现该新疗法能够通过提高肝脏凝血因子基因mRNA表达水平，从而达到改善凝血功能的作用。

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5 岳茂兴，周培根，梁华平，等. 20AA复方氨基酸联用大剂量维生素B6新疗法治疗创伤凝血障碍的多中心前瞻性临床研究操作实施方案[M/CD]. 中华卫生应急—卫生救护，2014：42-43.

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14 朱大年. 生理学[M].7版.北京：人民卫生出版社，2008.