LEDGF和HRP4在脑胶质瘤中的表达及其与预后的关系研究①

符黄德，黄海能，邓元央，黄华东，罗琨祥，李传玉，韦传东，陈源红，罗起胜②

（1.右江民族医学院附属医院神经外科，广西 百色 533000 E－mail：fuhuangde＠126.com；2.右江民族医学院附属医院检验科，广西 百色 533000；3.右江民族医学院基础医学院医学微生物和免疫教研室，广西 百色 533000）

脑胶质瘤是颅内最常见的肿瘤，约占颅内肿瘤的50%以上，具有高发病率、高病死率、高复发率和低治愈率的“三高一低”特点［1］。临床工作实践中传统的方式只能采取手术切除并辅以术后化疗的方式，治疗效果并不理想。随着现代分子生物学技术的迅速发展，靶向生物治疗逐步成为时下治疗脑胶质瘤潜在策略［2］。晶状体上皮源性生长因子（Lens epitheliumderived growth factor，LEDGF）和HRP4（Hepatoma－derived growth factor related protein－4）基因均是肝癌衍生生长因子 HDGF（Hepatoma－derived growth factor）家族成员之一，在正常情况下不仅主要能够在脑、心脏和睾丸等人体组织内表达，还可参与肿瘤细胞的生长、增殖、分化及血管生成等诸多肿瘤病理生理过程［3－4］。因此，本研究拟以我院诊治的54例脑胶质瘤患者为研究对象，探讨LEDGF 和HRP－4表达与脑胶质瘤预后的相关性，以及为脑胶质瘤的诊疗提供科学依据。现总结报道如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2003年2月～2013年6月间我院诊治的54例脑胶质瘤患者为研究对象，所有患者均经病理检查诊断证实。其中，男性32例，女性22例，年龄19～54岁，平均年龄（37.88±5.71）岁；中间变型性星形细胞瘤31例，胶质母细胞瘤16例，少枝胶质细胞瘤7例；WHO 标准分级：Ⅰ级16例，Ⅱ级22例，Ⅲ级12例，Ⅳ级4例。病例纳入标准依据：①白细胞≥4×109／L，血小板≥100×109／L；②心、肝、肾、肺功能基本正常；③未罹患免疫、消化、神经、循环系统等其它系统基础疾病；④Karnofsky功能评分均≥70分；⑤近4周内未接受过任何抗肿瘤治疗，预计生存时间＞3 个月。同期选取54例行颅脑损伤内减压手术患者为对照组，两组患者在年龄、性别、体重指数、Karnofsky功能评分方面的比较差异无统计学意义（P ＞0.05），见表1。所有患者及家属签署知情同意书，本研究方案通过右江民族医学院附属医院伦理委员会批准。

表1 两组患者一般临床资料比较 （±s）

表1 两组患者一般临床资料比较 （±s）

分组 n 年龄（岁）男性比例（n，%）体重指数（kg／m2）Karnofsky功能评分（分）对照组 54 38.56±5.25 32（59.26） 23.78±1.14 74.48±10.35胶质瘤组 54 37.13±5.91 33（61.11） 23.92±1.18 75.25±11.54 t／χ2 0.880 0.039 0.276 0.356 P 0.301 0.844 0.841 0.723

1.2 实时荧光定量聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）

1.2.1 主要仪器和试剂 总RNA 提取试剂盒由南京凯基生物科技发展有限公司提供；逆转录和荧光定量PCR 扩增试剂盒均购自于大连宝生物工程有限公司；荧光定量PCR 仪为美国赛默飞公司生产，型号7500 Fast型；PCR 引物的设计与合成均由上海生工生物公司承担完成，LEDGF、HRP－4引物序列，见表2。

表2 目的基因LEDGF、HRP－4和内参的引物序列

1.2.2 组织样品收集 将脑胶质瘤患者的肿瘤组织和颅脑损伤内减压手术切除的正常脑组织样品迅速置于液氮中冷冻，－80℃冰箱保存。

1.2.3 实时荧光定量PCR 利用Trizol法提取总RNA 并将其逆转录为cDNA。行实时荧光定量PCR，以β－actin作为内参对照；SYBR Green荧光PCR 反应参数条件为94℃预变性4 min，95℃，变性1 min、退火延伸60℃1min，75℃2 min，持续30个循环；选择SYBR Green I／HRM Dye通道，读取Ct值；分别计算基因的Ct值，采用2－△△Ct方法予以定量分析，并用β－actin的Ct值进行校正。

1.3 随访观察 追踪随访54例脑胶质瘤患者至2015年7月30日，第1年每1个月随访1次，之后每3个月随访1次；若患者中途死亡，则将死亡的时间设为截止日期；分析不同LEDGF 和HRP－4表达水平与生存时间的相关性。

1.4 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析。计量资料以（±s）的方式表示，两组间比较利用独立样本的Student－t分析；计数资料的两组间采用χ2检验；运用Kaplan－Meier法计算患者平均生存时间，两组间生存时间的差异采用Log－rank检验，P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组患者LEDGF 和HRP－4表达水平比较 如表3所示，胶质瘤组患者的LEDGF 和HRP－4表达水平均显著高于对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

表3 两组患者LEDGF和HRP－4表达水平比较 （±s）

表3 两组患者LEDGF和HRP－4表达水平比较 （±s）

分组 n LEDGF HRP－4对照组 54 1.00±0.00 1.00±0.00胶质瘤组 54 3.18±0.56 2.88±0.41 t 6.228 4.515 P ＜0.001 0.011

2.2 LEDGF表达与脑胶质瘤预后的关系 如图1所示，LEDGF高表达组的生存时间与LEDGF低表达组比较，差异无统计学意义（χ2＝2.171，P ＝0.141）。

2.3 HRP－4 表达与脑胶质瘤预后的关系 如图2所示，HRP－4高表达组的生存时间显著低于HRP－4低表达组，差异具有统计学意义（χ2＝9.731，P ＝0.002）。

图1 LEDGF表达与脑胶质瘤预后的关系

图2 HRP－4表达与脑胶质瘤预后的关系

3 讨论

LEDGF是一种分子量75kDa的蛋白，最早从老鼠的晶状体上皮细胞中分离得到，由530个氨基酸残基组成，也属HDGF 家族的主要成员之一［5］。依据LEDGF的功能可以将其分为N 端DNA／染色体结合区和C端整合酶结合区。LEDGF 无组织特异性，广泛分布于人体的各个器官组织细胞中，对细胞的增殖、凋亡和分化过程均产生重要的调节作用［6－7］。然而，遗憾的是，目前LEDGF 是否参与肿瘤细胞的增殖与侵袭及其是否对脑胶质瘤的预后有何影响尚不明确。本研究结果显示，脑胶质瘤患者组织LEDGF 的表达水平显著高于对照组，表明LEDGF 可能参与了脑胶质瘤的发生发展过程。众所周知，LEDGF可参与肿瘤血管的生长，并经由肿瘤细胞和血管内皮细胞的双向旁分泌作用，诱发机体产生细胞因子的瀑布式生理反应，进而加剧肿瘤细胞的增殖和新生血管的形成。因此，笔者有充分理由认为，胶质瘤患者中LEDGF 水平的增加，一方面可能是由于LEDGF 介导的促血管生成效应，另一方面则是LEDGF 对肿瘤细胞生长和增殖的促进作用。然而，在随访观察中，LEDGF 高表达与低表达组的生存时间比较并无明显差别，该结果提示其可能并不影响脑胶质瘤患者的预后。分析其原因可能有两点：首先，LEDGF 仅是肿瘤新生血管形成的激发因子，对于肿瘤组织的长时间维系和增大可能并无直接的作用；其次，LEDGF 主要早期表达于分裂旺盛和长寿命的细胞，而对无限增殖的肿瘤细胞或肿瘤细胞的转移、复发等特性并无直接的影响。

作为HDGF家族的另一成员，HRP－4是一种具有高度亲和肝素的生长因子，在正常组织和肿瘤组织中均可广泛表达，而且参与了肿瘤的血管形成、分化和转移过程，是诱发肺癌、肝癌、肾癌、黑色素瘤等多种肿瘤的关键促进因子［8－10］。本研究结果发现HRP－4的表达水平均明显高于正常对照组，表明HRP－4在脑胶质瘤的形成与发展过程中扮演重要角色。有研究显示，脑胶质瘤的形成和转移过程中伴随着多种代谢化学指标的改变，其中最为重要的因子便是血管生长相关因子［11］。因此，在脑胶质瘤中HRP－4的过表达实质上也是肿瘤发生发展过程中新生血管大量生成的主要原因。更值得关注的是，研究结果还显示，HRP－4高表达组患者的生存时间显著低于HRP－4低表达组，提示HRP－4可能参与影响脑胶质瘤的预后，提示靶向干预HRP－4的表达水平是提高脑胶质瘤预后的潜在治疗策略。

综上所述，本研究结果显示，LEDGF 和HRP－4在脑胶质瘤细胞中均呈现异常高表达，但是仅HRP－4的过表达与患者生存时间缩短密切有关，而LEDGF则可能并不直接参与影响脑胶质瘤的预后。

［1］ 杨群英，沈冬，赛克，等.初诊恶性脑胶质瘤患者综合治疗的生存情况分析［J］.中华医学杂志，2013，93（1）：8－10.

［2］ 戴宜武，王振光，秦家振.脑胶质瘤治疗进展［J］.中华临床医师杂志：电子版，2013，7（14）：10－12.

［3］ Ishihara K，Fatma N，Bhargavan B，et al.Lens epithelium－derived growth factor deSumoylation by Sumo－specific protease－1regulates its transcriptional activation of small heat shock protein and the cellular response［J］.FEBS J，2012，279（17）：3048－70.

［4］ Guo S，Liu HD，Liu YF，et al.Hepatoma－derived growth factor：a novel prognostic biomarker in intrahepatic cholangiocarcinoma［J］.Tumor Biol，2015，36：353－364.

［5］ 张大为，何红秋，郭顺星.LEDGF／p75蛋白的可溶性表达、纯化及功能研究［J］.药学学报，2014，49（8）：1200－1207.

［6］ Eidahl JO，Crowe BL，North JA，et al.Structural basis for high－affinity binding of LEDGF PWWP to mononucleosomes.［J］.Nucleic Acids Res，2013，41（6）：3924－3936.

［7］ Jenny L，Miriam R，Claudia L，et al.Oncogenic Human Papillomaviruses Activate the Tumor－Associated Lens Epithelial－Derived Growth Factor（LEDGF）Gene［J］.Plos Pathogens，2014，10（3）：e1003957.

［8］ Chen FF，Lin WH，Lin SC，et al.Significance of heparin binding to basic residues in homologous to the amino terminus of hepatoma－derived growth factor and related proteins［J］.Glycobiology，2012，22（5）：649－661.

［9］ 孙景仙，刘炎锋，高玉美.HDGF在恶性肿瘤预后中的研究进展［J］.中国现代普通外科进展，2013，16（11）：915－917.

［10］ Enomoto H，Nakamura H，Liu W，et al.Hepatomaderived growth factor：its possible involvement in the progression of hepatocellular carcinoma［J］.Int J Mol Sci，2015，16（6）：14086－14097.

［11］ 陈立坚，杨薇.1H－MRS 在颅内单发脑转移瘤诊断中的应用现状［J］.右江民族医学院学报，2015，37（1）：146－147.