益气活血药对心肌梗死大鼠心室缝隙连接蛋白43表达及室颤发生的影响

吴爱明，娄利霞，张冬梅，柴立民，聂 波，赵明镜

·基础医学论著/研究·

益气活血药对心肌梗死大鼠心室缝隙连接蛋白43表达及室颤发生的影响

吴爱明，娄利霞，张冬梅，柴立民，聂 波，赵明镜

目的 探讨益气活血药(生脉注射液联合血塞通注射液)对心肌梗死大鼠心室缝隙连接蛋白43(Cx43)表达及室颤发生的影响。方法 采用结扎心脏左冠状动脉前降支的方法建立心肌梗死大鼠模型，另设假手术(只穿线，不结扎)作对照。术后随机分为模型组、假手术组、卡托普利组和益气活血组。卡托普利组给予卡托普利片4.39 mg/(kg·d)溶解灌胃；益气活血组给予生脉注射液3.51 mL/(kg·d)，血塞通注射液17.54 mg/(kg·d)腹腔注射；模型组和假手术组给予生理盐水，疗程4周。治疗结束后取材，采用real time PCR法检测左心室梗死边缘区Cx43 mRNA的表达；Western blot法检测Cx43蛋白表达；在体电刺激记录室颤诱发率。结果 与假手术组比较，模型组Cx43的mRNA和蛋白表达均显著降低(P<0.05或P<0.01)；与模型组比较，卡托普利组和益气活血组Cx43的mRNA和蛋白表达均显著升高(P<0.05或P<0.01)。在体电刺激室颤诱发率模型组最高，卡托普利组和益气活血组的室颤诱发率降低，差异有统计学意义(P<0.05)。结论 生脉注射液联合血塞通注射液可以减少心肌梗死后室颤的发生，其机制与改善心室Cx43表达有关。

心肌梗死；心室颤动；缝隙连接蛋白43；益气活血

缝隙连接蛋白43(Cx43)是心室表达最丰富的缝隙连接蛋白。Cx43所构成的缝隙连接为心肌细胞间电信号的传导提供了直接通道，对维持心律协调同步具有非常重要的意义。心肌梗死后Cx43遭受破坏，导致心电传导异常，为室性心律失常的形成提供了基本条件[1]。益气活血法是中医治疗心律失常的基本治法。本研究在其指导下，采用生脉注射液联合血塞通注射液对心肌梗死大鼠进行实验性干预，观察其对心室Cx43基因和蛋白表达以及室颤发生的影响，为阐明益气活血药治疗心肌梗死后心律失常的疗效和机制提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 成年雄性SD大鼠，体重200 g～240 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

1.2 主要仪器 ALC-V8动物呼吸机(上海奥尔科特生物科技有限公司)、BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)、Mx3000P实时荧光定量PCR仪(美国安捷伦 Stratagene公司)、Bio-Rad稳压稳流电泳仪、垂直电泳槽和转膜仪(美国Bio-Rad公司)。

1.3 主要试剂 Oligo(dT)15Primer，dNTP Mix，M-MLV Reverse Transcriptase均为Promega公司产品。SYBR Green PCR Master Mix为ABI公司产品。Cx43多克隆抗体(货号：sc-6560-R)为Santa cruz公司产品。

1.4 模型制备方法 大鼠经1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，经喉气管插管，机械通气，左胸前区备皮消毒，于第三、四肋间隙逐层开胸，暴露心脏，结扎左冠状动脉前降支(假手术只穿线，不结扎)，然后将心脏复位，逐层缝合。心电图ST段显著抬高为结扎成功。术后给予青霉素抗感染。

1.5 分组给药方法 大鼠术后随机分为模型组、假手术组、卡托普利组和益气活血组。参照徐淑云《药理实验方法学》中的等效剂量换算公式计算大鼠药量，具体药量如下：卡托普利组给予卡托普利片(中美上海施贵宝制药有限公司)4.39 mg/(kg·d)充分溶解灌胃；益气活血组给予生脉注射液(雅安三九药业有限公司)3.51 mL/(kg·d)、血塞通注射液(昆明制药集团股份有限公司)17.54 mg/(kg·d)腹腔注射；模型组和假手术组给予生理盐水。疗程为4周。

1.6 在体电刺激诱发室颤方法 治疗结束后，大鼠用1%戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔注射麻醉，仰卧位固定，经喉气管插管，机械通气，开胸暴露心脏，连接BL-420F生物机能实验系统，记录Ⅱ导联心电图，同时将刺激电极正极置于心尖部，负极置于正极右侧约3 mm处的左室前壁非梗死区，以程控电刺激参数：每串10个刺激波，脉宽5 ms，刺激电压1 V递增，记录各组大鼠在9 V刺激电压时的室颤发生率。

1.7 心肌组织Cx43 mRNA检测方法 采用real time PCR法，用Primer Premier 5软件进行引物设计。Cx43，120bp forward：5′-TTCATGCTGGTGGTGTCC-3′；reverse：5′-AGTGGTGGCGTGGTAAGG-3′。GAPDH，95bp forward：5′-GCTCTCTGCTCCTCCCTGTTCTAGA-3′；reverse：5′-CCGTTCACACCGACCTTCACCAT-3′。扩增条件为：95 ℃ 10 min预变性，95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸20 s，40次循环。Cx43 mRNA的相对表达量按照2(-ΔΔct) 法计算。

1.8 心肌组织Cx43蛋白检测方法 采用Western blot法，心肌组织加入适量液氮研磨破碎，在冰浴下裂解，离心提取总蛋白，BCA法蛋白定量，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭后依次与相应特异性一抗和二抗孵育，用化学发光法获取条带，扫描胶片后用IPP6.0软件进行条带灰度分析，计算目的蛋白的相对表达量。

2 结 果

2.1 Cx43 mRNA表达检测结果 与假手术组比较，模型组左心室梗死边缘区Cx43 mRNA的表达下调(P<0.05)，卡托普利组和益气活血组的表达上调(P<0.01)。与模型组比较，卡托普利组和益气活血组的Cx43 mRNA表达上调(P<0.01)。详见图1。

注：与假手术组比较，*P<0.05；与模型组比较，#P<0.05，##P<0.01；n= 5。

图1 各组大鼠左心室梗死边缘区Cx43 mRNA表达的比较

2.2 Cx43 蛋白表达检测结果 与假手术组比较，模型组左心室梗死边缘区Cx43蛋白表达显著下调(P<0.01)。与模型组比较，卡托普利组和益气活血组的蛋白表达显著上调(P<0.05或P<0.01)。详见图2。

注：与假手术组比较，**P<0.01；与模型组比较，#P<0.05，

##P<0.01；n= 3。

图2 各组大鼠左心室梗死边缘区Cx43 蛋白表达的比较

2.3 电刺激室颤诱发率结果 在体电刺激实验，在9 V刺激电压下，不同组间的室颤诱发率不同，经卡方检验，差异有统计学意义(P<0.05)。其中模型组室颤诱发率最高，卡托普利组有所降低，益气活血组的室颤诱发率明显降低，与假手术组相近。详见图3。

注：经卡方检验，χ2=8.504，P=0.037。图中数字为动物数。

图3 各组大鼠在体电刺激室颤诱发率的比较

3 讨 论

据世界卫生组织2013年7月公布的调查结果，冠心病是全球范围的头号杀手，每年约有700万人死于冠心病，其中冠心病心肌梗死患者的死亡风险居高不下，患者多因并发恶性心律失常而猝死。因此，对心肌梗死后心律失常的干预研究具有重要的现实意义。

心肌细胞间的电偶联障碍是导致心律失常的重要诱因，其致心律失常作用不亚于兴奋性异常和膜离子通道功能的紊乱。缝隙连接是维持心脏正常电偶联的关键结构。Cx43在心室中表达最丰富，Cx43的损伤和重构与室性心律失常的发生关系密切。研究发现，Cx43基因敲除小鼠在成长到2月龄时，会全部死于自发性室性心律失常[2]。Cx43基因部分敲除小鼠的心肌Cx43表达较正常水平下降了50%，通过结扎左冠状动脉前降支诱导急性心肌缺血时，与野生型小鼠相比较，Cx43基因部分敲除小鼠的自发性室性心动过速发生率增加了2倍，并且在运动实验中首次自发性室性心动过速出现的更早，发生频率更高，同时室性心律失常的持续时间也更长，证明了Cx43表达的降低是心肌梗死后室性心律失常发生的直接诱因[3]。由此提示，保护Cx43是抑制心律失常从而降低心肌梗死患者猝死风险的潜在干预靶点。

中医药治疗心律失常有着悠久的历史和独到的见解。早在《内经》中就有“心澹澹大动、心怵惕”的描述。心律失常属中医学“心悸、怔忡”等范畴，为本虚标实、虚实夹杂之证，其证型常复杂多变，但引起心律失常的必要环节均是“心脉瘀阻”，形成“心脉瘀阻”的基本因素是“心脏亏虚”，即“心脏亏虚”和“心脉瘀阻”是各类心律失常的共同病机[4]。因此，益气活血法是本病的基本治法。一些具有益气和活血作用的中药可以抑制心律失常的发生，生脉注射液由红参、麦冬、五味子组成，功效益气养阴，复脉固脱，可用于心肌梗死后心悸症状的改善。研究证实，生脉注射液对缺血性心律失常[5]和再灌注损伤所致的心律失常[6]具有较好的治疗作用，可以降低心内膜单项动作电位复极时间，增强心脏的电稳定性[7]。血塞通注射液的主要成分是三七总皂苷，功效活血祛瘀，通脉活络，具有良好的抗心肌缺血作用。研究表明血塞通注射液可有效对抗家兔心肌缺血再灌注性心律失常[8]。

本研究在益气活血法指导下，采用生脉注射液联合血塞通注射液对心肌梗死大鼠进行实验性干预，观察其对心室Cx43基因和蛋白表达以及室颤发生的影响。结果显示，心肌梗死大鼠左心室梗死边缘区Cx43 mRNA和蛋白表达均显著降低，导致心肌细胞间不能形成有效的缝隙连接通道，使心电冲动传导异常，易于诱发心律失常。此时模型组大鼠在电刺激诱发室颤的实验中，室颤的诱发率最高。生脉注射液联合血塞通注射液治疗组、卡托普利治疗组大鼠的Cx43 mRNA和蛋白表达较模型组明显上调，改善了缝隙连接通道介导的心电传导，使室颤的诱发率明显降低。提示生脉注射液和血塞通注射液联合应用具有抑制心肌梗死后室颤发生的作用，其机制与改善左心室Cx43的表达有关。

[1] Fana XZ，Zhu HJ，Wu X，et al.Effects of doxycycline on cx43 distribution and cardiac arrhythmia susceptibility of rats after myocardial infarction[J].Iran J Pharm Res，2014，13(2)：613-621.

[2] Gutstein DE，Morley GE，Tamaddon H，et al.Conduction slowing and sudden arrhythmic death in mice with cardiac-restricted inactivation of connexin43[J].Circ Res，2001，88(3)：333-339.

[3] Lerner DL，Yamada KA，Schuessler RB，et al.Accelerated onset and increased incidence of ventricular arrhythmias induced by ischemia in Cx43-deficient mice[J].Circulation，2000，101(5)：547-552.

[4] 魏执真.心律失常中医诊治[M].北京：中国协和医科大学出版社，1998：10-27.

[5] 古天明，肖业伟，王西霞，等.生脉注射液抗家兔缺血性心律失常的作用[J].华西药学杂志，2009，24(1)：42-44.

[6] 席孟杰.生脉注射液防治再灌注损伤所致心律失常[J].医药论坛杂志，2003，24(14)：18-19.

[7] 邱燕祥.生脉注射液对缺血性心律失常兔心内膜MAP的影响[J].吉林医学，2012，33(9)：1861.

[8] 王大伟，李俊，莫成荣.中药注射液抗家兔心肌缺血再灌注性心律失常的实验研究[J].安徽中医学院学报，2007，26(3)：37-39.

(本文编辑 郭怀印)

The Influence of Yiqi Huoxue Drugs on the Expression of Connexin 43 and Ventricular Fibrillation in Rats with Myocardial Infarction

Wu Aiming，Lou Lixia，Zhang Dongmei，Chai Limin，Nie Bo，Zhao Mingjing

Zhao Mingjing

Objective To study the effects of Yiqi Huoxue drugs(YQHX，combine Shengmai injection with Xuesaitong injection) on the expression of connexin 43(Cx43)and ventricular fibrillation in rats with myocardial infarction.Methods Model rats of myocardial infarction were established by occlusion of the left anterior descending coronary artery，the sham operation group was without occlusion.After operation rats were randomly divided into sham operation group，model group，YQHX group and captopril group.YQHX[Shengmai injection 3.51 mL/(kg·d)and Xuesaitong injection 17.54 mg/(kg·d)] were administered intraperitoneally.Captopril[4.39 mg/(kg·d)] and distilled water (for the sham operation and model groups) were administered orally.The course of treatment was 4 weeks.The expressions of Cx43 mRNA of myocardium in left ventricular infarct border zone were detected by real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction after treatment.The expression of Cx43 protein was observed by western blot.The incidence of ventricular fibrillation was recorded by electric stimulation in vivo.Results Compared with sham operation group，the expressions of Cx43 mRNA and protein decreased remarkably in the model group (P<0.05 orP<0.01).Compared with model group，the expressions of Cx43 mRNA and protein increased significantly in YQHX group and captopril group (P<0.05 orP<0.01).The incidence of ventricular fibrillation was the highest in model group.The incidence of ventricular fibrillation reduced significantly in captopril group and YQHX group(P<0.05).Conclusion Shengmai injection and Xuesaitong injection can reduce the occurrence of ventricular fibrillation after myocardial infarction.It is related to improving the expressions of Cx43.

myocardial infarction；ventricular fibrillation；connexin 43；Yiqi Huoxue drugs

国家自然科学基金资助项目(No.81202685)；北京市教委科研基地项目(No.2012)

北京中医药大学东直门医院中医内科学教育部和北京市重点实验室

赵明镜，E-mail：mjgx2004@163.com

R541.7 R285.5

A

10．3969/j．issn．1672-1349．2015．16．008

1672-1349(2015)16-1837-03

2015-04-11)