复方丹参注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤的影响

陈 元，朱登安，魏晓艳，曹 凯，王银凤，吴茜茜

(武警湖北总队医院急诊科，湖北 武汉 430064)

心肌缺血再灌注损伤是临床上常见的病理生理过程，其机制十分复杂。现已证实，细胞因子释放，相关基因调控在心肌缺血再灌注过程中发挥了重要作用。复方丹参在心血管疾病临床治疗中应用广泛，可能的机制是保护血管内皮细胞，抗心肌缺血作用，改善血液代谢以及对心肌的保护作用。本研究通过大鼠心肌缺血再灌注模型建立，研究复方丹参液对心肌缺血再灌注损伤过程中NF-κB 蛋白活性变化及相关炎性细胞因子表达的影响，探讨复方丹参液对心肌保护作用的可能机制。

1 材料与方法

1.1 动物模型建立与分组

1.1.1 动物模型制作 经腹腔注射20%乌拉坦(5ml/kg)，麻醉完成后行气管切开，接呼吸机行机械辅助通气，沿胸骨左缘进入胸腔，游离左冠状动脉前降支。用6-0 的丝线套扎左冠状动脉前降支，丝线穿过一塑料管腔，通过向下推动塑料管压向心室壁，冠脉血流阻断;放松丝线冠脉血流再灌注。

1.1.2 实验动物及分组 SD 雄性大鼠60 只，(PDF 级，武汉大学医学院实验动物中心提供)，按抽签法随机分成3组，每组20 只。A组(假手术对照组):游离冠状动脉前降支但不结扎;B组(缺血再灌注组):缺血30min，再灌注60min;C组(复方丹参液处理组):于缺血前30min 腹腔注射复方丹参液1.5ml/kg，余同B组。A、B组缺血前30min 注射生理盐水(1.5ml/kg)。

1.2 检测方法及观测指标

1.2.1 心肌梗死面积的测定(TTC 染色) 各组分别取10 只SD 大鼠，其中B组、C组再灌注结束后，将左冠状动脉前降支重新结扎，从舌静脉注射0.5%伊文氏蓝1.5ml，迅速取左心室心肌，冰冻切片后，行2，3，5-三苯基氯化四氮唑染色(TTC 染色)。应用HPIAS-2000 图像分析软件分别测出缺血区面积和梗死区面积;缺血区面积以心肌缺血区占左心室面积的百分比表示;梗死区面积以梗死区面积占缺血区面积的百分比表示。

1.2.2 血浆TNF-α、IL-10 的测定(酶联免疫吸附实验，ELISA) 分别采取各组10 只大鼠静脉血取血清。ELISA 法检测各组TNF-α、IL-10 血浆浓度(按照试剂盒说明书操作)。

1.2.3 心肌组织NF-κB 活性测定 分别采取各组余下10 只大鼠左心室取心肌提取蛋白，进行SDS-PAGE 蛋白电泳，转印到PVDF 膜上。加入一抗兔抗大鼠NF-κB p65 多克隆抗体孵育过夜，洗膜后，加入二抗羊抗兔IgG 孵育。将PVDF 膜应用ECL 化学发光检测。图像处理软件测出条带灰度值，用以表示NF-κB 蛋白活性。

2 结果

2.1 复方丹参液对缺血再灌注心肌梗死面积的影响 B组梗死面积为(45 ±3)%，C组梗死面积为(30 ±5)%，两者比较有明显差异(P ＜0.01)，见表1。

表1 3组心肌缺血面积及梗死面积、血浆TNF-α、IL-10 浓度变化()

表1 3组心肌缺血面积及梗死面积、血浆TNF-α、IL-10 浓度变化()

与B组比较，* P ＜0.01;与A组比较，△P ＜0.01

2.2 复方丹参液对缺血再灌注大鼠血浆炎性细胞因子的影响 缺血再灌注后血浆炎性细胞因子TNF-α、IL-10 浓度分别为(187 ± 12)pg/ml 和(724 ±50)pg/ml，与A组相比均显著上升(P ＜0.01)。C组血浆TNF-α、IL-10 的浓度分别为(58±6)pg/ml 和(287 ±47)pg/ml，低于B组(P ＜0.01)。见表1。

2.3 心肌NF-κB 的表达活性变化 如图1 所示，A组心肌NF-κB 活性为(22 ±5)，B组心肌NF-κB活性为(42 ± 4)，与A组相比显著上升(P ＜0.01)。C组心肌NF-κB 活性为(28 ±4)，低于B组(P ＜0.01)。

图1 各组心肌NF-κB 蛋白表达

3 讨论

缺血再灌注损伤是常见的临床病理生理现象，缺血再灌注损伤主要病理生理学改变包括:心肌细胞坏死、再灌注性心律失常、心肌收缩功能障碍以及冠状微循环障碍［1］。在心肌缺血再灌注损伤的病理生理过程中炎性细胞因子发挥了重要作用［2］。

TNF-α 能诱导白细胞在组织中聚集、粘附，释放白三烯、血小板活化因子、IL-10、IL-6 等炎性介质。炎性因子TNF-α 在机体体液炎性反应中有启动、触发作用。白细胞和内皮细胞的激活粘附是缺血再灌注后心肌病理损伤的关键，而TNF-α 是激活这些细胞的主要介质。通过离体大鼠心肌灌注模型观察到了缺血再灌注损伤心肌TNF-α 水平升高［3］。而抑制心肌缺血后TNF-α 的表达，能明显改善心肌功能和减轻心肌损伤［4］。

IL-10 是炎症调控的枢纽位置的重要炎性介质，在缺血再灌注损伤中比反应蛋白或肌酸激酶更敏感。研究证实在大鼠急性心肌缺血再灌注时血清中IL-10 呈高表达［5］。在利用IL-10 单克隆抗体治疗后可以缓解缺血再灌注损伤的发生，明显改善损伤心肌结构，提示IL-10 参与了缺血再灌注损害的病理过程。由此可见，IL-10 在心肌缺血再灌注损伤中发挥了具有重要意义的作用。血浆IL-10 浓度可敏感反应组织损伤的程度，IL-10 水平也与心肌损伤密切相关［6］。

在本实验中采用经典的大鼠心肌缺血再灌注损伤模型，发现经过缺血再灌注刺激后，体内循环中的TNF-α、IL-10 浓度均较对照组明显增高。

NF-κB 是在炎症损伤机制中普遍存在的转录因子，在调节炎症反应和免疫应答基因中起重要作用。TNF-α、IL-10 两种细胞因子均受核因子-κB的调控［7］。本实验研究显示NF-κB 的活化，以及随后的细胞因子的转录都参与了心肌缺血再灌注损伤过程，如抑制NF-κB 活性可以减少促炎细胞因子的释放，减少心肌梗死面积。本实验结果表明在心肌再灌注后NF-κB 的活性表达水平较对照组明显上升，血浆中细胞因子IL-10、TNF-α 水平也明显增加。

复方丹参液是我国传统的中药制剂，具有抗炎、抗氧化、保护血管内皮细胞作用，同时抑制动脉粥样斑块形成，维持内膜增生血管内皮细胞相关介质一氧化氮(NO)和血管收缩因子内皮素-1(ET-1)等之间的平衡稳定性。复方丹参液能抑制脂质过氧化反应，清除心肌损伤中氧自由基，提高心肌对缺氧的耐受性，改善缺氧心肌代谢活力。复方丹参液显著降低核因子及其调控的促炎细胞因子TNF-α、IL-10 水平可能与升高缺血再灌注心肌组织中超氧化物歧化酶(SOD)活性和增强机体的非特异性免疫力，对特异性细胞免疫双向调节作用这两方面因素有关［8］。

本实验阐明了复方丹参液可以通过减少心肌核因子-κB 蛋白活化，减少促炎细胞因子的释放，改善缺氧心肌代谢活力。这可能是其在缺血再灌注心肌保护作用中的分子学机制之一。

［1］Cai ZP，Parajuli N，Zheng X，et al.Remote ischemic preconditioning confers late protection against myocardial ischemia-reperfusion injury in mice by upregulating interleukin-10［J］.Basic Res Cardiol，2012，107(4):277

［2］Kim SC，Boehm O，Meyer R，et al.A murine closed-chest model of myocardial ischemia and reperfusion［J］.J Vis Exp，2012，17(65):e3896

［3］Parajuli N，Yuan Y，Zheng X，et al.Phosphatase PTEN is critically involved in post-myocardial infarction remodeling through the Akt/interleukin-10 signaling pathway［J］.Basic Res Cardiol，2012，107(2):248

［4］Markowski P，Boehm O，Goelz L，et al.Pre-conditioning with synthetic CpG-oligonucleotides attenuates myocardial ischemia/reperfusion injury via IL-10 up-regulation［J］.Basic Res Cardiol，2013，108(5):376

［5］Hausenloy DJ，Yellon DM.The therapeutic potential of ischemic conditioning:an update［J］.Nat Rev Cardiol，2011，8(11):619

［6］Khaliulin I，Clarke SJ，Lin H，et al.Temperature preconditioning of isolated rat hearts-a potent cardioprotective mechanism involving a reduction in oxidative stress and inhibition of the mitochondrial permeability transition pore［J］.J Physiol，2007，581(pt3):1147

［7］Matar F，Mroue J.The management of thrombotic lesions in the cardiac catheterization laboratory［J］.J Cardiovasc Transl Res，2012，5(1):52

［8］Schoenborn JR，Wilson CB.Regulation of interferon-γ during innate and adaptive immune responses［J］.Adv Immunol，2007，96:41