白藜芦醇对侧脑室注射链脲佐菌素诱导学习记忆障碍大鼠的保护作用*

张玉霖，欧阳昌汉，张又枝

(湖北科技学院药学院，湖北 咸宁 437100)

阿尔茨海默病(Alzheimer＇s Disease，AD)/老年性痴呆是老年痴呆最常见的类型，是严重危害老年人身心健康的一类疾病。该病以进行性学习记忆、认知功能减退，思维障碍为主要症状，以大脑皮质萎缩、神经元丢失等为主要病理改变的神经变性病变。伴随着人口老龄化，AD 发病率也越来越高，对人类生活质量的影响乃至生命的威胁也日趋严重。因此，深入探讨AD 的发病机制，研究有效的防治措施是摆在医学界面前迫切需要解决的一项重大课题。

AD 发病机制还不十分清楚，目前有多种假说，如β-淀粉样蛋白(amyloid β-protein，Aβ)假说、胆碱能损伤假说、自由基损伤假说、能量代谢障碍假说等。由于AD 发病机制复杂，目前还没有治疗AD 的特效药物，因此开发高效、低价的抗AD药物具有较高的社会和经济价值。

白藜芦醇(resveratrol，Res)是一类主要存在于藜芦、葡萄、花生等植物中的非黄酮类多酚类化合物，在中药虎杖里的含量也很高。研究显示，白藜芦醇具有抗炎、抗癌、抗氧化及保护心血管等多种生物学活性［1］，被广泛应用于食品、化妆品、医药等领域。

侧脑室注射链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)大鼠模型能很好的模拟阿尔茨海默病(Alzheimer＇s Disease，AD)病的改变［2］，因此常被作为阿尔茨海默病的模型应用［3］。

研究证实，Res 对AD 小鼠认知能力具有一定保护作用［4］，但对侧脑室注射链脲佐菌素的AD大鼠是否有保护作用鲜见报道，本研究以侧脑室注射链脲佐菌素建立AD 大鼠模型，通过Morris水迷宫实验，评价白藜芦醇对大鼠认知功能的影响，为临床应用参考。

1 材料与方法

1.1 材料 健康雄性Wistar 大鼠50 只，体质量200～280g，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供。白藜芦醇、链脲佐菌素，美国Sigma 公司;其他试剂，分析纯。脑立体定位仪、颅骨钻，美国Stoelting 公司;Morris 水迷宫，中国医学科学院药物研究所。

1.2 方法

1.2.1 分组给药及模型制作 50 只大鼠随机分为5组，分别为假手术组、模型对照组、RES Ⅰ组(10mg/kg)、RES Ⅱ组(20mg/kg)和RES Ⅲ组(30mg/kg)每组10 只。造模前，RES Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组大鼠分别用3.3mg/ml、6.6mg/ml 和9.9mg/ml 的RES 溶液(20%环糊精/生理盐水为溶媒)灌胃;假手术组和模型对照组大鼠用生理盐水灌胃;各组均按按体质量3ml/(kg·d)灌胃，共持续2 周。第7d 灌胃后1h，用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠后，参考《大鼠脑立体定向图谱》［5］，将大鼠的脑袋固定在脑定位仪上，剪去局部毛发，消毒后沿矢状线做一长约1.5cm 的切口。除假手术组外，各组大鼠于中线旁1.4mm，前囟后0.8～0.9mm 处钻孔，深度3.6mm，每侧侧脑室用微量进样器注射10%STZ(人工脑脊液为溶媒)约3μl/100g，第3d重复注射此剂量。假手术组注射等量人工脑脊液以代替10%STZ。每次注入时间为3min，留针1 min。无菌骨蜡封闭钻孔，术区滴注庆大霉素，缝合消毒。术后继续灌胃给药，同时肌注青霉素、庆大霉素共5d 防止感染。

1.2.2 水迷宫实验测定大鼠记忆能力成模3周，用Morris 水迷宫(MWM)检测各组大鼠学习记忆能力。试验分为定位航行实验和空间探索实验［6］。①定位航行实验:4 个象限潜伏期的均值作为该天的成绩，记为平均逃避潜伏期，进行统计分析，实验历时5d。②空间探索实验:第6d 撤除平台，从第一象限任选一个入水点将大鼠放入，记录在120s 内大鼠穿过平台所在位置的次数，计算1 min 穿越原平台的次数，记录大鼠在120s 内搜索平台的路线图。

2 结果

2.1 定位航行实验 由表1 可知，随着训练天数的增加，各组大鼠平均逃避潜伏期均有所缩短;与假手术组比较，模型对照组从第2d 开始平均逃避潜伏期明显延长(P ＜0.01)。与模型对照组比较，RES 10mg/kg 剂量组第4、5d 平均逃避潜伏期明显缩短(P ＜0.05 或P ＜0.01);RES 20mg/kg 剂量组第3～5d 平均逃避潜伏期明显缩短(P ＜0.01);RES 30mg/kg 剂量组大鼠从第2d 开始平均逃避潜伏期明显缩短(P ＜0.05 或P ＜0.01)。定位航行实验各组大鼠寻找并爬上平台的路线见图1。

表1 白藜芦醇对AD 模型大鼠定位航行实验平均逃避潜伏期的影响(，n=10)

表1 白藜芦醇对AD 模型大鼠定位航行实验平均逃避潜伏期的影响(，n=10)

与假手术组比较，* P ＜0.01;与模型对照组比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

图1 Morris 水迷宫定位航行实验第5d 各组大鼠寻找并爬上平台的路线图

2.2 空间探索实验 与假手术组比，模型对照组大鼠每min 穿越原平台位置次数明显减少(P ＜0.05);与模型对照组比，RES(20mg/kg)组和RES(30mg/kg)组组大鼠每min 穿越原平台位置次数明显增多(P ＜0.05)(图2)。Morris 水迷宫空间探索实验中各组大鼠在120s 内搜索平台的路线见图3。

图2 白藜芦醇对AD 模型大鼠Morris 水迷宫空间探索实验每min 穿越原平台位置的次数的影响()

图3 Morris 水迷宫空间探索实验中各组大鼠在120s 内搜索平台的路线图

3 讨论

阿尔茨海默病(Alzheimer＇s Disease，AD)属弥漫性中枢神经退行性疾病，以渐进性记忆力减退、认知障碍为特征，是老年期常见的疾病。AD 的发病机制十分复杂，严重危害了老年人的身心健康。链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)属亚硝基脲类衍生物，在外周可以选择性破坏胰岛细胞致糖尿病;在中枢它可以阻断胰岛素受体的自身磷酸化和酪氨酸激酶的活性，影响胰岛素受体的功能［7］，引起大鼠学习、记忆损伤［8］。

Morris 水迷宫(Morris water maze)是英国心理学家Morris 发明并应用于测试动物空间学习记忆能力的一种装置。通过隐藏平台获得实验及空间探索实验，采集动物的逃避潜伏期、原平台象限停留时间等实验参数，衡量与空间学习记忆相关的脑功能，评价能影响学习记忆的药物效果［9］。

条件反射是学习记忆实验方法的基础，MWM为训练动物形成条件反射提供了条件，动物通过迷宫来学习任务，也通过迷宫检测记忆能力。目前，Morris 水迷宫仍是筛选痴呆动物模型和评价药物效果最可靠的方法之一［10］。经典的MWM测试方法主要包括定位航行试验和空间探索试验两部分。我们的MWM 测试结果显示，与假手术组比，模型对照组大鼠第2d 开始定位航行试验平均逃避潜伏期明显延长，空间探索试验每分钟穿越原平台位置次数明显减少，说明侧脑室注射STZ 获得的AD 模型大鼠，空间认知能力明显损伤，表明了造模的成功;同时，与模型对照组比，RES 各组大鼠定位航行试验平均逃避潜伏期一定程度缩短，RES20、30mg/kg 剂量组大鼠空间探索试验每min 穿越原平台位置次数明显增多，说明RES 有保护AD 大鼠学习记忆的作用。

［1］刘铭，刘伟，蒋杰，等.白藜芦醇类似物的合成及其抗氧化活性［J］.中国新药杂志，2011，20(10):914

［2］Chu WZ，Qian CY.Expressions of Abetal-40，Abetal-42，tau202，tau396 and tau404 after intracerebroventricular injection of streptozotocin in rats［J］.Di Yi Jun Yi Da Xue Xue Bao，2005，25(2):168

［3］Sharma M，Gupta YK.Intracerebrorentricular injection of streptoxotocin in rats produces both oxidative stress in the brain and congnitive impairment［J］.Life Sciences，2001，68(9):1021

［4］倪南珍，王敏，林茂，等.白藜芦醇对阿尔茨海默病小鼠记忆能力及脑组织NOS 和NO 含量的影响［J］.遵义医学院学报，2014，37(1):99

［5］包新民，舒斯云.大鼠脑立体定向图谱(Ⅲ)［M］.北京:人民出版社，1991:12

［6］郑东，柯志强，尧青.姜黄素对糠尿病大鼠大脑的影响［J］.湖北科技学院学报(医学版)，2015，29(3):191

［7］Sonkusare S，Srinivasan K，Kaul C，et al.Effect of donepezil and lercanidipine on memory impairment induced by intracerebrove ntricular streptozotocin in rats［J］.Life Sci，2005，77(1):1

［8］Lannert H，Hoyer S.Intracerebroventricular administration of streptozotocin causes long-term diminutions in learning and memory abilities and in cerebral energy metabolism in adult rats［J］.Behav Neurosci，1998，112(5):1199

［9］陈罗西，郭玲玲，李亮.Morris 圆形水迷宫的应用及其相关检测指标分析［J］.辽宁中医药大学学报，2008，10(8):55

［10］D＇Hooge R，De Deyn PP.Applications of the Morris water maze in the study of learning and memory［J］.Brain Res Brain Res Rev，2001，36(1):60