基于微量筛选模型的48 种中草药提取物乙酰胆碱酯酶抑制活性筛选及评价

周思多，王 晓，冯金红，耿岩玲，赵恒强*

1 山东农业大学食品科学与工程学院，泰安 271018;2 山东省科学院中药过程控制研究中心

山东省大型精密分析仪器应用技术重点实验室 山东省分析测试中心，济南 250014

阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s Disease，AD)，又称早老性痴呆症，是发生于老年和老年前期以进行性神经退化为特征的大脑退行性病变［1］。随着世界老龄人口的不断增加，AD 病发病率在国内外呈不断上升的趋势，成为威胁老年人生命健康的主要疾病之一。目前，多方面的研究表明，AD 的病理与患者神经间隙中乙酰胆碱酯酶活性过高具有重要关系［2，3］。因此，乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase Inhibitor，AChEI)药物是目前研究最多、最为活跃的抗老年性痴呆症药物。

我国中药材资源极其丰富，中药治疗老年痴呆历史悠久，有丰富的理论基础和实践经验。从中药千层塔中发现的石杉碱甲［4］和黄皮酰胺［5］，经药理研究表明对AD 患者有显著的治疗作用。从中草药中寻找抗老年痴呆成分，为研制新型抗老年痴呆创新药物及开发中草药资源均具有重要意义。目前，已公开的AChE 抑制剂的主流筛选方法均由Ellman法改进而来。这些方法以大鼠脑组织匀浆为酶源，且没有微量化［6-8］。孙黔云等［9］发展了乙酰胆碱酯酶抑制剂微量筛选模型，该方法具有高效、快速等优点，可以大大加快中药活性成分的发现进程。

本研究采用微量化AChE 抑制剂筛选模型，对48 种中草药的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行大规模的系统筛选，为寻找来自中草药的乙酰胆碱酯酶抑制剂提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 试剂与材料

电鳗AChE 购自Sigma 公司;碘化硫代乙酰胆碱(Acetylthiocholine iodide，AChI)购自Fluka 公司;5，5-二硫双硝基苯甲酸(Dithiobisnitrobenzoic acid，DTNB)购自Sigma 公司;毒扁豆碱(Eserine)购自Sigma 公司;其它试剂均为进口或国产分析纯;实验用水为Milli-Q 超纯水(18.2 MΩ)。本实验所用的中草药样品购于济南市建联大药店，由山东省分析测试中心王晓研究员鉴定。

1.2 仪器与设备

Tecan Infinite M200 型多功能酶标仪(瑞士TECAN 集团公司);MICROTESTTM96 孔酶标板(美国BD 公司);KQ-400KDE 型高功率数控超声波仪(昆山市超声仪器有限公司);R201 型旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司);FA1104 型电子天平(上海精天电子仪器厂);Milli-Q(18.2 MΩ)超纯水处理系统(美国Millipore 公司)。

1.3 样品溶液的制备

准确称取样品1.0 g，置于100 mL 具塞三角烧瓶中，加入50 mL(水、80%乙醇、乙酸乙酯、石油醚)提取溶剂，于超声提取器中提取30 min，重复提取一次过滤，滤液合并，转入100 mL 旋蒸瓶中旋转蒸发至干，称重。使用时依次用50%乙醇溶解并分别稀释至50 mg/L 和1000 mg/L，备用。

1.4 溶液的配制

乙酰胆碱酯酶(AChE):准确称取一定量电鳗AChE(2.32 mg，500 U)，用50 mmol/L，pH=7.4 磷酸盐缓冲液稀释至1.0 U/mL。

磷酸盐缓冲液(PBS)(50 mmol/L，pH=7.4):用100 mM Na2HPO4和NaH2PO4，按照体积比VNa2HPO4:VNaH2PO4=77.4:22.6 配制。

显色剂(2.5 mmol/L，DTNB 溶液):准确称取一定量DTNB，用50 mmol/L，pH=7.4 磷酸盐缓冲液稀释到一定浓度。

底物(10 mmol/L，AChI 溶液):准确称取一定量AChI，用50 mmol/L，pH=7.4 磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度。

终止剂(1% 十二烷基硫酸钠(SDS)):准确称取一定量SDS，用磷酸盐缓冲液稀释至一定浓度。

阳性对照品:毒扁豆碱(Eserine)(7.69×10-2mg/L、3.85 mg/L)，用50 mmol/L，pH=7.4 磷酸盐缓冲液配制。

1.5 筛选模型

1.5.1 实验原理

碘化硫代乙酰胆碱(AChI)在乙酰胆碱酯酶(AChE)作用下分解，生成硫代胆碱(Thiocholine)，硫代胆碱与显色剂DTNB 迅速作用，生成在405 nm处有光吸收的黄色物质。

1.5.2 实验方法

实验采用改良的Ellman 方法进行［10］。首先，取溶于50%乙醇的样品溶液20 μL，依次加入80 μL PBS、40 μL 2.5 mmol/L 的DTNB、20 μL 酶液(1.0 U/mL)，振荡混匀，37 ℃预孵10 min，然后加入40 μL 10 mmol/L 的底物，37 ℃反应10 min，加入60 μL 1%的SDS 终止反应，用酶标仪测定405 nm吸收值，记为A样品。

1.6 中草药活性成分的筛选

方法如1.5.2 所述:取20 μL 溶于50%乙醇的样品溶液，依次加入各种反应试剂，测其A405，记为A样品;同时每批样品都做溶剂对照，即用50%乙醇代替样品的乙醇溶液，其吸光度记为A对照;再做空白对照，即用40 μL PBS 代替底物AChI，记为A空白。在405 nm 下测量吸光值并根据下式计算抑制率。

抑制率(%)=［A对照-(A样品-A空白)］/A对照×100

式中，A对照为用50%乙醇溶液代替样品溶液时的吸光值;A样品为添加样品溶液时的吸光值;A空白为添加样品溶液但没有添加底物AChI(用40 μL PBS代替底物AChI)时的吸光值。所有实验重复三次并计算平均值和标准偏差，阳性对照为毒扁豆碱。

2 结果与讨论

2.1 中药提取物的AChE 抑制活性

按照1.3 样品溶液的制备方法提取制备中草药样品，采用改良的基于Ellman 法的微量筛选模型，按照1.5 中草药粗提物的乙酰胆碱酯酶抑制活性评价实验所述条件进行。根据测得各对照品、样品、样品空白的吸光度，按照1.6 所述抑制率计算公式进行计算，得到48 种中草药不同极性溶剂提取物在实验体系中高、低两种终浓度(76.92，3.85 mg/L)的乙酰胆碱酯酶抑制活性，结果见表1。

表1 中药提取物的AChE 抑制活性Table 1 AChE inhibitory activity of different traditional Chinese medicine extracts

注:毒扁豆碱在实验体系中终浓度为7.69×10-2 mg/L、3.85 mg/L 时的抑制率分别为57.22±0.04%、88.85±0.01%。Note:when the final concentrations of eserine in the experimental system were 7.69×10-2 mg/L and 3.85 mg/L，the inhibitory rates were 57.22±0.04%and 88.85±0.01%，respectively.

从表1 中可以看出，当提取物在实验体系中终浓度为76.92 mg/L 时，黄柏80%乙醇提取物、元胡80%乙醇提取物、丹参乙酸乙酯提取物AChE 抑制率较高，其值均在45%以上。其中，黄柏80%乙醇提取物抑制率最高，其值为66.72±0.02%。而且，这三种中药提取物的抑制率与终浓度为7.69×10-2mg/L 毒扁豆碱的乙酰胆碱酯酶抑制率(57.22±0.04%)较为接近。另外，部分药材不同极性溶剂提取物对AChE 抑制率为负值。如:当提取物在实验体系中终浓度为76.92 mg/L 时，柏子仁乙酸乙酯提取物的AChE 抑制率为-8.63±-0.10%、五味子80%乙醇提取物的AChE 抑制率为-7.92±-0.20%。这在蕨类植物和海藻提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性研究中也有类似现象［11，12］。

2.2 提取溶剂的影响

本研究选择4 种不同极性提取溶剂(水、80%乙醇、乙酸乙酯、石油醚)提取制备中草药样品。根据表1 数据，对比提取溶剂与提取物抑制率的关系，可以看出有以下规律特征:

首先，少数中药材不同极性溶剂提取物具有一定的AChE 抑制活性。如:黄柏水提取物的抑制率为42.08±0.02%(76.92 mg/L)、80%乙醇提取物的抑制率为66.72±0.02%(76.92 mg/L);丹参乙酸乙酯提取物的抑制率为46.84±0.03%(76.92 mg/L)、石油醚提取物的抑制率为46.28±0.06%(76.92 mg/L)。

其次，同一药材的不同极性溶剂提取物的AChE 抑制活性可能相差较大。如:当提取物在实验体系中终浓度为76.92 mg/L 时，元胡80%乙醇提取物抑制率为52.67±0.04%，而同浓度下其石油醚提取物抑制率仅为3.27±0.48%。这可能与不同极性提取溶剂所提取的化合物种类及含量均有不同有关。

第三，几种不同品种中药材的同一极性溶剂提取物均具有较好的AChE 抑制活性。这可能是因这几种中药材的同一极性溶剂提取物所含化学成分结构类型相似所致。如:当提取物在实验体系中终浓度为76.92 mg/L 时，黄柏、元胡80%乙醇提取物均有较强的AChE 抑制活性，其所含化学成分主要是生物碱类化合物［13，14］。

参考相关文献可知，已发现的具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的化合物种类较多、极性差异大［13，14］。这与本研究的结果一致，说明中草药中不同极性和结构类型的化合物均有可能具有乙酰胆碱酯酶抑制活性，选择适当极性的提取溶剂对中草药样品进行有效提取，是准确快速的发现AChEI 的前提和保障。

2.3 提取物浓度的影响

中草药提取物浓度对酶的抑制活性也有一定影响。提取物浓度太高，基质对酶活性的影响会增强;提取物浓度太低，其中所含活性成分含量相应减少，又会造成对酶的抑制效果不明显，产生假阴性结果。本研究选取中草药粗提物在实验体系中高、低两种终浓度(76.92 mg/L 和3.85 mg/L)用于AChE 抑制活性研究。

从表1 可以看出，当中药提取物在实验体系中终浓度为3.85 mg/L 时，多数中药提取物的AChE抑制率较低，其值一般在10%以下。

当提取物在实验体系中终浓度为76.92 mg/L时，具有乙酰胆碱酯酶抑制性的中药提取物其大多数AChE 抑制率较高，如:黄柏水提取物的AChE 抑制率从3.08±0.13%(3.85 mg/L)变为42.08±0.02%(76.92 mg/L);少数中药提取物对AChE 抑制活性表现出减弱趋势，如:五味子石油醚提取物AChE 抑制率从终浓度3.85 mg/L 时的25.45±1.96%变为终浓度76.92 mg/L 时的3.26±0.43%。

2.4 中药提取物IC50值的测定

选取对乙酰胆碱酯酶抑制活性明显的黄柏80%乙醇提取物，元胡80%乙醇提取物，丹参乙酸乙酯提取物，精密吸取上述提取物储备液，用50%乙醇稀释成八个浓度梯度(50～2000 mg/L)，采用改良的Ellman 法微量筛选模型，按照1.5 中草药粗提物的乙酰胆碱酯酶抑制活性评价实验所述条件进行。根据测得各对照品、样品、样品空白的吸光度，按照1.6 所述抑制率计算公式进行计算，得到上述中草药不同溶剂提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性，计算IC50(mg/L)值，结果见表2。

表2 三种中草药提取物的乙酰胆碱酯酶抑制作用(n=3)Table 2 Acetylcholinesterase inhibitory activities of 3 TCM extracts(n=3)

由表2 可知，黄柏80%乙醇提取物，元胡80%乙醇提取物，丹参乙酸乙酯提取物的IC50值分别为295.12、229.09、1202.26 mg/L。其中，元胡80%乙醇提取物的IC50值最低，黄柏80%乙醇提取物的IC50值次之，丹参乙酸乙酯提取物的IC50值最大。三种中草药提取物对乙酰胆碱酯酶活性有一定抑制作用，但与阳性对照品毒扁豆碱IC50值有一定差距，这可能与提取物中具有AChE 抑制活性的有效成分含量较低或者提取物的基质成分复杂有关。活性成分追踪筛选和分离纯化工作有待于进一步进行。

3 结论

采用基于酶标仪的微量筛选模型对48 种中药不同极性溶剂提取物的乙酰胆碱酯酶抑制活性进行考察。结果表明，当提取物在实验体系中终浓度为76.92 mg/L 时，黄柏80%乙醇提取物、元胡80%乙醇提取物和丹参乙酸乙酯提取物的AChE 抑制活性较高，其IC50值分别为295.12、229.09、1202.26 mg/L。另外，提取物浓度对乙酰胆碱酯酶抑制活性有一定影响。本研究结果为从中草药中快速筛选潜在的乙酰胆碱酯酶抑制剂提供了方法和数据支持。

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