贵州野生甜藤多糖的提取与脱蛋白方法研究

常 飞，王绍云，陈 飞

1 凯里学院化学与材料工程学院，凯里 556011;2 贵州大学精细化工研究中心，贵阳 550025

甜藤Paederia Scandens(Lour.)Merr，又名鸡屎藤、牛皮冻、斑鸠饭、青风藤等，为茜草科甜藤属多年生草质藤本，主要分布于印度、日本、中国等地。在我国有广阔的生长区域，主要分布于长江流域及其南部地区［1，2］。甜藤作为民间常用草药已有数千年历史，主治疗风湿疼痛，腹泻痢疾，肮腹疼痛，气虚浮肿，头昏食少，肝脾肿大，瘰疬，肠痈，无名肿毒，跌打损伤等［3］，近年研究发现鸡屎藤水提取液具有较强的抑菌作用［4-7］，用于治疗消化系统疾病疗效独特。在贵州鸡屎藤既是苗族习用药材，又是贵州侗族人民喜欢的野生蔬菜，是贵州“甜藤粑”、“侗果”等传统特色美食的主要原料。甜藤嫩茎含有丰富的营养物质，如抗坏血酸、膳食纤维、胡萝卜素、多种矿物质和多种氨基酸［8］。此外，甜藤中还含有一些生物活性物质如多糖(或甙类)、黄酮及其甙类、环烯醚萜类等［9］。而大量文献证实植物多糖具有广泛的生物活性，如增强免疫力、抗肿瘤、抗细菌活性、降血脂、降血糖、抗衰老等作用，已经应用到保健品、药品、食品和化妆品等领域。植物多糖常混有较多蛋白质，蛋白质存在不仅可能影响其生理活性和多糖的结构，且可能导致药理作用下降。近年来，对甜藤植物的研究主要是对其化学成分和临床应用等方面，而对其中多糖的提取及脱蛋白方法的研究鲜见报道，因此对甜藤多糖的研究具有十分重要的意义。本实验以贵州野生甜藤为原料，对甜藤多糖的提取条件和甜藤粗多糖脱蛋白方法进行研究，以确定甜藤多糖最佳提取条件和脱蛋白方法，为贵州野生甜藤资源的开发利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

甜藤于2013 年5 月采自贵州凯里。经本院周江菊教授鉴定为茜草科鸡屎藤属多年生蔓性草质藤本植物［Paederia scandens(Lour.)Meer.］。将新鲜甜藤嫩茎在60 ℃下干燥至恒重，粉碎，过40 目筛，作为甜藤多糖提取实验材料。

葡萄糖标准品(纯度为99.9%，美国Sigma 公司)，其他试剂均为国产分析纯。实验用水均为蒸馏水。蒽酮试剂:称取0.2 g 蒽酮加入到100 mL 浓硫酸中，搅拌使其溶解、冷却，即得蒽酮试剂，转入棕色瓶中(现配现用)。

UV-2550 紫外-可见分光光度计，日本岛津公司;SG250HDT 超声波清洗器，由上海冠特生产;TGL-16C 高速台式离心机，上海安亭科学仪器厂;RE-52AA 旋转蒸发仪，上海雅莱生化仪器设备有限公司;ZK-82A 型真空干燥箱，上海市实验仪器厂;多功能粉碎机，北京科伟永兴仪器有限公司;AR2140型电子分析天平，由奥斯国际贸易有限公司生产。

1.2 实验方法

1.2.1 葡糖糖标准曲线的建立及甜藤多糖含量的测定

采用蒽酮-硫酸法［10，11］，准确称取23.3 mg 葡萄糖标准品于100 mL 容量瓶中，加蒸馏水溶解，定容并摇匀，此时浓度为0.233 mg/mL 葡萄糖标准液。取6 只10 mL 具塞试管，分别精密量取葡萄糖标准液0.00、0.10、0.20、0.30、0.40、0.50 mL，分别补水至1.00 mL，加入蒽酮试剂4 mL，摇匀，同时置于沸水浴中加热10 min，取出流水冷却后，常温下静置10 min。以首管为空白于620 nm 处测定吸光度。以葡萄糖标准液质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制葡萄糖标准曲线，进行线性回归，得回归方程:y=8.9571x+0.0317，R2=0.9991，结果葡萄糖质量浓度在0.0233～0.1165 mg/mL 范围内与吸光度值具有很好的线性关系。

精确吸取待测液2.00 mL，加入蒽酮试剂4 mL，同标准曲线之操作，测定吸光度值。利用标准曲线测定甜藤样品中多糖含量。

1.2.2 蛋白脱除率和多糖损失率的测定

1.2.2.1 蛋白脱除率的测定

吸取粗多糖溶液1.00 mL 于25 mL 量瓶中，加蒸馏水稀释定容，摇匀，得稀释液。以蒸馏水为参比，测定稀释液在260 nm 和280 nm 处的吸光度。根据经验公式:蛋白质浓度(mg/mL)=1.45×A280-0.74×，算得蛋白质含量，从而计算蛋白脱除率。

蛋白脱除率=［(m1-m2)/m1］×100%

式中:m1为粗多糖溶液中蛋白质量;m2为除蛋白后多糖溶液中蛋白质量。

1.2.2.2 多糖损失率的测定

利用葡萄糖标准曲线测定脱蛋白前后甜藤粗多糖溶液中多糖含量，从而计算多糖的损失率。

多糖损失率=［(m3-m4)/m3］×100%

式中:m3为粗多糖溶液中多糖质量;m4为脱蛋白后多糖溶液中多糖质量。

1.2.3 甜藤多糖提取工艺探究

1.2.3.1 提取工艺流程

新鲜甜藤茎→洗涤干净→干燥→粉碎→过40目晒→用水为提取溶剂→超声辅助提取→减压过滤→滤渣再重复提取1 次→合并过滤→旋蒸浓缩→加入无水乙醇至乙醇体积分数80%→4 ℃冰箱中静止24 h→以4000 rpm 离心10 min→抽滤收集沉淀→用无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤沉淀→真空干燥→粗多糖。取甜藤粗多糖约0.1 g→精密称定→蒸馏水溶解→定容500 mL→摇匀→得甜藤粗多糖溶液。

1.2.3.2 单因素试验

多糖的提取参阅文献［13，14］方法改进，水是最好的溶剂，超声辅助提取法比回流提取法简便且快速，本研究采用超声辅助提取法。影响植物多糖提取效果较为显著的因素主要是料液比、水浴温度、超声提取时间、超声功率，分别进行单因素试验探究其影响水平。

1.2.3.3 正交试验

通过单因素试验结果，设计L9(34)正交试验优化提取条件，因素水平设计见表1。

1.2.4 甜藤多糖脱蛋白方法研究

1.2.4.1 Sevag 法［15］

取甜藤粗多糖溶液50 mL，加入1/5 体积的Sevag 试剂(氯仿∶正丁醇=4∶1，V/V)，剧烈振摇20 min，转入分液漏斗中，静止至分层去除交界处变性蛋白质和下层有机相，保留上层水相以4000 rpm 离心15 min，得脱蛋白处理液，测定波长260 nm、280 nm 处蛋白吸收峰，比较除蛋白效果。取4 份粗多糖溶液，按前述步骤分别处理1、2、3、4 次，按“1.2.2.1项、1.2.2.2 项”测定不同处理次数后蛋白脱除率和多糖损失率。

表1 正交试验的因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments

1.2.4.2 三氯乙酸(TCA)法［16，17］

取甜藤粗多糖溶液6 份，各50 mL，分别加入等体积的各种浓度的三氯乙酸水溶液，依次为4%、6%、8%、10%、12%、14%，充分震荡至溶液不再浑浊，放置1.5 h，以4000 r/min 离心15 min，弃去沉淀，上清液滴加NaOH 饱和溶液，使溶液pH 为7.0，测定蛋白脱除率和多糖损失率。首先考察哪种浓度的三氯乙酸溶液脱蛋白效果最好，然后再试验脱蛋白处理次数。

1.2.4.3 TCA-Sevag 法［17］

取甜藤粗多糖溶液50 mL，加入50 mL10%TCA 溶液和10 mL 氯仿-正丁醇(4∶1)溶液，搅拌1 h，4000 rpm 离心15 min，去除交界处变性蛋白质，取上清液(水相)，测定蛋白脱除率和多糖损失率。按照前述方法考察TCA-Sevag 法脱蛋白次数的效果。

1.2.4.4 HClO4法

取甜藤粗多糖溶液6 份，各50 mL，以1∶1(V/V)分别加入不同浓度(1%、2%、3%、4%、5%、6%)高氯酸溶液，摇匀至溶液不再浑浊，静置30 min，4000 rpm 离心10 min，取上清液，用NaOH 饱和溶液调节溶液pH 至7.0，测定蛋白脱除率和多糖损失率。考察不同浓度高氯酸溶液脱蛋白情况，确定最佳浓度后，考察高氯酸法处理1、2、3、4 次后的脱蛋白效果。

2 结果与讨论

2.1 甜藤多糖提取单因素试验结果

2.1.1 料液比对甜藤多糖提取效果的影响

在超声功率80 W，水浴温度50 ℃，超声60 min条件下，探索料液比对甜藤多糖提取效果的影响，结果见图1A。

由图1A 可知，多糖得率随料液比的增加，刚开始增加很明显后缓慢增加，当料液比由1∶40 增加到1∶50 时多糖得率只增加了0.006%，从节约方面考虑，故选择1∶30、1∶40 和1∶50 三个水平进行正交试验。

2.1.2 超声时间对甜藤多糖提取效果的影响

在超声波功率80 W，水浴温度50 ℃，料液比1∶40(m/V)的条件下，探索超声提取时间对甜藤多糖提取效果的影响，结果见图1B。

由图1B 可知，当超声提取时间达到110 min 时多糖得率达到最高，再延长时间，多糖得率反而下降。说明有少部分多糖被降解了，可能由于超声波的空化效益和强烈的机械振动效应，超声时间过长使局部温度和压强过大，使多糖发生变性或结构不稳定的大分子多糖断裂而损失。故选择70、90 min和110 min 三个水平进行正交试验。

2.1.3 水浴温度对甜藤多糖提取效果的影响

在超声功率80 W，超声提取时间60 min，料液比1∶40 的条件下，探索水浴温度对甜藤多糖提取效果的影响，结果见图1C。

由图1C 可知，随着水浴温度的升高，多糖得率不断增加，温度由30 ℃到50 ℃阶段多糖得率曲线较陡，再升高温度，多糖得率只是略有升高，但温度较高时溶液的稠度增大，考虑到节约资源和过滤的难度，故选择50、60 ℃和70 ℃三个水平进行正交试验。

2.1.4 超声功率对甜藤总糖提取效果的影响

利用超声波产生的空化效应和强烈的机械振动可以加速植物中有效成分进入溶剂，料液比1∶40(m/V)，在水浴温度50 ℃条件下，超声60 min，探索超声功率对甜藤多糖提取效果的影响，结果见图1D，随着超声功率的增加，多糖增加很明显，当功率达到80 W 时，达到最高，但超声功率100 W 时，吸光度反而下降，可能由于超声波功率过高使少量多糖降解，故选择70 W 和80、90 W 三个水平进行正交试验。

图1 料液比(A)、超声时间(B)、水浴温度(C)和超声功率(D)对多糖提取效果的影响Fig.1 Effects of solid/liquid ratio(A)，ultrasonic time(B)，water bath temperature(C)，ultrasonic power(D)on the extraction yield of polysaccharides

2.2 甜藤多糖提取正交试验结果

取正交试验所得的样品溶液，按照1.2.1 项下方法测定，结果见表2。由表2 极差R 分析，各因素对甜藤多糖提取效果影响大小依次排列为:料液比(A)＞超声时间(C)＞超声功率(D)＞水浴温度(B)，通过正交试验直观分析得到最佳提取工艺是:A3B3C3D1。

表2 正交试验方案及结果Table 2 Orthogonal experimental program and results

图2 Sevag 法脱蛋白结果Fig.2 Deproteinization results using Sevag method

为了验证结果的可信度。取甜藤样品约5 g，精密称取3 份，按正交试验所得的最佳条件进行实验，测定甜藤多糖的平均得率为1.61%(RSD 为0.66%)，结果说明该工艺可行，即原料与溶剂按1∶50(m/V)进行混合，在超声功率70 W、水浴温度70 ℃下，超声提取110 min，提取2 次。

2.3 甜藤多糖脱蛋白方法研究结果

2.3.1 Sevag 法

从图2 可知，Sevag 法脱蛋白率较低，处理次数增加，蛋白脱出率和多糖损失率成比例的增加，蛋白脱出率最高只能达到40.72%，但多糖损失率已达到51.17%，结果说明了有部分多糖与蛋白质结合比较牢固，脱出蛋白质的同时，也有部分的多糖被带走了，所以多糖的损失率也在相应的增加。

图3 不同浓度的TCA 脱蛋白结果Fig.3 Deproteinization results with different concentrations of TCA

2.3.2 TCA 法

图4 不同次数TCA 法脱蛋白的结果Fig.4 Deproteinization results with different times of TCA

由图3 可知，用不同浓度三氯乙酸与等体积粗多糖溶液混合进行脱蛋白试验，结果三氯乙酸浓度为15%时，蛋白脱出率最好73.72%，多糖损失率为16.54%。以最佳的三氯乙酸浓度15%，进行多次脱蛋白处理，结果由图4 可知，随着处理次数的增加，蛋白脱出率增加不多，但是多糖损失较大。

2.3.3 TCA-Sevag 法

图5 TCA-Sevag 法脱蛋白结果Fig.5 Deproteinization results using TCA-Sevag method

由图5 看出，增加处理次数，多糖损失率较大幅度地增大，而蛋白质的去除效果却基本不变。

2.3.4 HClO4法

图6 不同浓度的HClO4脱蛋白结果Fig.6 Deproteinization results with different concentrations of HClO4

图7 不同次数HClO4法脱蛋白结果Fig.7 Results of different times of deproteinization using HClO4method

由图6、图7 可知，HClO4法脱除甜藤多糖中蛋白质与高氯酸浓度和脱蛋白次数有关，当加入高氯酸浓度为4%(与粗多糖溶液等体积混合后，混合液中高氯酸浓度为2%)时，脱蛋白效果最好，经3 次脱蛋白处理后，蛋白脱出率达到94.78%，多糖损失率为15.14%;经4 次脱蛋白处理后，蛋白脱出率达到95.02%，多糖损失率为17.95%，可见，使用高氯酸溶液脱甜藤多糖蛋白，只需3 次处理就能达到满意结果。

2.3.5 四种脱蛋白方法的比较

根据以上实验研究，不同方法对甜藤多糖去除蛋白质的效果有较大差别，Sevag 法去除甜藤多糖蛋白的效果最差，且多糖损失大，效率不高;三氯乙酸脱蛋白率较高，多糖损失率较Sevag 法低，但是费时。TCA-Sevag 法虽然处理一次就能得到较好的脱蛋白效果，但所用试剂种类多导致成本上升，操作比较繁琐，而且不容易达到纯化目的，易造成环境的污染，不可取。HClO4法是最佳的甜藤多糖脱蛋白方法，蛋白脱出率高且多糖损失率小，而且方法简单，所用试剂种类少，易于提纯，且对环境友好，易于推广。

2.3.6 甜藤多糖脱蛋白方法的定性分析

图8 脱蛋白处理前后的紫外光谱扫描图Fig.8 UV spectra of samples before and after deproteinization

用HClO4法脱蛋白处理前后，进行定性分析，结果见图8。从图8 可知，经过4 次脱蛋白处理后，在260 nm 和280 nm 处只有少量吸收，说明大部分蛋白质已经被去掉，只有与多糖结合牢固的少量蛋白质没有被除去。

3 结论与讨论

植物中多糖提取方法有很多，本实验采用超声辅助提取甜藤多糖，经单因素试验和正交试验得出了贵州野生甜藤多糖的最佳提取工艺:以水为溶剂，料液比1∶50(m/v)，在超声功率60 W、水浴温度70℃下，超声提取时间110 min，提取2 次，所得提取效率最高为1.61%。该法工艺简单可行，可作为甜藤多糖的提取工艺。

目前多糖含量测定方法最常用的是蒽酮-硫酸法、苯酚-硫酸法两种方法［18-20］，其两种方法的基本原理是多糖在浓硫酸作用下，水解成单糖，然后脱水生成具有呋喃环结构的糠醛衍生物，糠醛衍生物可与蒽酮、苯酚试剂发生反应生成有色的化合物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于多糖的定量。本实验采用蒽酮-硫酸法来测定脱蛋白前后多糖含量，主要是考虑到该方法测定条件比较温和，易控制，线性、重复性和稳定性较高;另外，苯酚-硫酸法对苯酚的纯度要求比较严格，其纯度直接影响该实验测试结果的准确度;再者，对于本实验来讲，主要还研究了甜藤多糖的脱蛋白方法，从结果误差和重现性来讲蒽酮-硫酸法测定脱蛋白前后多糖含量更为合理准确。

在目前所查到的文献中，还未见有关HClO4法用于去除植物中蛋白质，本实验参阅文献［21］基础上，首次采用高氯酸探究植物多糖脱蛋白效果，经过实验研究，获得满意结果。HClO4法是一种有效的去除甜藤多糖蛋白质的方法，且工艺简单，成本低，具有一定的应用价值。

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