Folin-Ciocalteu 比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的研究

段海霞，林云霞，张金荣，严小军，骆其君

宁波大学海洋学院 教育部应用海洋生物技术重点实验室，宁波 315211

铜藻(Sargassum horneri)，又名丁香屋，隶属圆子纲(Cyclospreae)、墨角藻目(Fucales)、马尾藻科(Sargassaceae)、马尾藻属(Sargassum)，为北太平洋西部特有的暖温带性海藻。铜藻在我国沿海分布广泛，是暖温带海域营造海洋牧场，进行生物修复海洋生态的首选品种［1］。铜藻作为海藻工业的优质原料，已广泛用于食品、饲料工业，具有较高的商业价值［2，3］。近年来，随着我国海藻资源开发利用研究的快速发展，铜藻因富含多糖、褐藻多酚、岩藻黄素等多种生物活性物质而引起了人们的广泛关注，但对其中褐藻多酚的研究不多［4］。褐藻多酚(phlorotannins)是海洋褐藻中重要的次级代谢产物，化学结构上是一类以间苯三酚为基础骨架的独特的多酚类化合物，其聚合度可以几个至几百个，并具有抗氧化、抗菌、抗病毒、抗心血管疾病、抗糖尿病综合症、保肝等多种生物活性［5-7］。严小军等以Folin-Denis法测定了中国常见海藻的褐藻多酚含量，并研究了褐藻多酚含量随海藻生长及季节的变化规律［8］。

目前，植物多酚含量测定的最常见方法——Folin-Ciocalteu 比色法［9-11］。鉴于褐藻多酚的化学结构类型为多酚类化合物，故本研究选择Folin-Ciocalteu 比色法进行铜藻中褐藻多酚的含量测定。以没食子酸为标准品，分别考察检测波长、显色温度、显色时间、Folin-Ciocalteu 试剂和碱液用量等测定条件对Folin-Ciocalteu 比色法的影响，确定Folin-Ciocalteu 比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的最优条件，为铜藻中褐藻多酚提取工艺的研究提供理论依据。

1 材料与仪器

1.1 材料

新鲜铜藻于2013 年5 月采自浙江温州南麂岛，样品由宁波大学骆其君教授鉴定，编号为NJD20130501，保存于宁波大学海洋学院。

1.2 仪器

752N 紫外-可见分光光度计(上海精密科学仪器有限公司);HH-4 数显恒温水浴锅(常州国华电器有限公司);SB4200D 超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司);BSA124S-CW 电子天平(北京赛多利斯科学仪器有限公司);超纯水仪(Pall 公司);RXZ-380B 型智能人工气候箱(宁波江南仪器厂);移液器(德国Eppendorf 公司);1 cm 石英比色皿(上海尤尼柯仪器有限公司)。

1.3 试剂

Folin-Ciocalteu 试 剂(Sigma 公 司，批 号BCBL4436V);没食子酸标准品(Sigma 公司，批号AGM01-HOSS);其余试剂均为国产分析纯。

2 实验方法

2.1 没食子酸标准溶液的配制

精密称取没食子酸对照品0.100 g，用重蒸馏水完全溶解并定容至100 mL，配成质量浓度1000 μg/mL 没食子酸储备溶液(现配)。

2.2 没食子酸工作液的配制

用移液管分别移取1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mL 的没食子酸标准储备液于100 mL容量瓶中，分别加水定容至刻度，摇匀，配置质量浓度分别为15、20、25、30、35、40、45、50 μg/mL 的没食子酸工作液，待用。

2.3 供试品溶液的制备

称取新鲜铜藻1.000 g 于锥形瓶中，加入50 mL 60%(V/V)乙醇溶液，40 ℃超声提取30 min，过滤至50 mL 容量瓶，加60%乙醇定容至50 mL，待用。

2.4 Folin-Ciocalteu 法测定褐藻多酚的比色条件优化

2.4.1 检测波长的选取

精密量取没食子酸工作液(50 μg/mL)、供试品溶液1.0 mL 于10 mL 容量瓶中，分别加水稀释，加1.25 mL Folin-Ciocalteu 试剂，混匀，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混匀，30 ℃避光反应60 min，以试剂空白为对照，在400～800 nm 范围内扫描确定最大吸收波长。

2.4.2 显色温度的考察

精密量取没食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀释，加入Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL，混匀，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混匀，分别于15、20、25、30、35、40 ℃条件下避光反应60 min，以试剂空白为对照，在760 nm 处测定溶液吸光值，以考察反应温度对比色效果的影响。

2.4.3 显色时间的影响

取没食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀释，加入Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL，混匀，3 min后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混匀，30 ℃分别避光反应30、60、90、120、150、180 min，以试剂空白为对照，在760 nm 处测定溶液吸光度，以确定显色完全的最佳时间。

2.4.4 Folin-Ciocalteu 试剂的加入量

取没食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀释，分别加入0.75、1.0、1.25、1.5、1.75 mL Folin-Ciocalteu 试剂，混匀，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混匀，30 ℃避光反应60 min，以试剂空白为对照，在760 nm 处测定溶液吸光度，以考察Folin-Ciocalteu 试剂用量对显色效果的影响。

2.4.5 Na2CO3溶液用量的确定

取没食子酸工作液(50 μg/mL)1.0 mL，加水稀释，加Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL，混匀，3 min，分别加入3.2、4.0、4.8、5.6、6.4 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混匀，30 ℃避光反应60 min，以试剂空白为对照，在760 nm 处测定溶液吸光度，考察Na2CO3溶液用量对吸光度的影响。

2.5 标准曲线的绘制

精密量取不同浓度的没食子酸工作液各1.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，加水稀释，分别加入1.25 mL Folin-Ciocalteu 试剂，混匀，3 min 后加入0.1 g/mL Na2CO3溶液4.0 mL，加水定容至10 mL，混匀，30 ℃避光反应60 min，以试剂空白为对照，在760 nm 处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，没食子酸溶液质量浓度为横坐标绘制标准曲线，褐藻多酚含量以没食子酸标准品计。

2.6 Folin-Ciocalteu 法测定铜藻中褐藻多酚的方法学评价

2.6.1 稳定性实验

精密量取同一铜藻供试品溶液按2.4 的测定条件，分别在样品液与显色剂反应完全(60 min)后的0、30、60、90、120 min 测定吸光度，以评价该方法在一段时间内的稳定性。

2.6.2 重现性实验

分别取同一铜藻样品5 份，依2.3 的方法制备供试品溶液，分别测定其多酚含量，计算结果的相对标准偏差(RSD)，以评价该方法的重现性。

2.6.3 精密度实验

采用优化的Folin-Ciocalteu 比色法对同一铜藻供试液测定5 次，并计算结果的相对标准偏差(RSD)，以评价该方法的精密度。

2.6.4 加标回收实验

精密量取已知含量的铜藻供试品溶液0.5 mL，6 份，分别加入1000 μg/mL 没食子酸工作液0.14、0.14、0.17、0.17、0.20、0.20 mL，加水稀释，混匀，加入Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL，混匀，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混匀，30 ℃避光反应60 min，分别测定混合样品中褐藻多酚含量，并计算其回收率和相对标准偏差，以评价该分析方法的准确性和可靠性。

2.7 含量测定

精确量取2.3 中的铜藻供试液1.0 mL，5 份，加水稀释，混匀，加入Folin-Ciocalteu 试剂1.25 mL，混匀，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混匀，30 ℃避光反应60 min。反应完全后，利用紫外-可见分光光度计，于760 nm 下测定体系吸光值，根据没食子酸标准品所得标准曲线，计算铜藻供试液中褐藻多酚的含量，公式如下:

褐藻多酚含量(mg/g)=C×V/m

式中，C:铜藻供试液中多酚浓度(mg/mL);V:铜藻供试液总体积(mL);m:铜藻质量(g)。

3 结果与分析

3.1 检测波长的确定

多酚类物质与Folin-Ciocalteu 试剂反应显色是基于Folin-Ciocalteu 试剂中的钨钼酸能将多酚化合物定量氧化，自身被还原，生成蓝色物质，在680～780 nm 有较大吸收，测定显色反应后溶液的紫外-可见吸收光谱，选择最大吸收波长作为比色法的测定波长。图1 为没食子酸工作液(50 μg/mL)和供试品溶液分别与Folin-Ciocalteu 试剂显色后的全波长扫描图，由图1 可知，两者均在760 nm 处有最大吸收，故选择760 nm 为检测波长。

图1 没食子酸(a)、供试品(b)和试剂空白(c)分别与Folin-Ciocalteu 试剂显色后的全波长扫描Fig.1 Scanning spectra of gallic acid(a)，testing solutions(b)and sample blank(c)reacted with Folin-Ciocalteu reagent

3.2 显色温度和时间的确定

图2 吸光度随反应温度的变化Fig.2 The absorbance at different reaction temperatures

酚类化合物与Folin-Ciocalteu 试剂反应需要一定显色温度和时间才能显色完全。由图2 可知，没食子酸标准溶液在不同温度条件下显色，显色温度对比色效果影响较大，反应温度过低、过高均不利于多酚显色。当温度低于30 ℃时，吸光度较小。30℃显色，反应60 min 时，吸光度达到最大，吸光值为0.705。35～40 ℃，显色60 min 时，吸光度逐渐减小。说明温度高能加快显色进程，但是温度过高，反应体系的稳定性较差。综合考虑显色的完全程度和反应体系的稳定性，确定显色温度为30 ℃。

图3 吸光度随反应时间的变化Fig.3 The absorbance at different reaction times

没食子酸标准溶液在不同温度条件下显色，达到最大吸光度的时间有差异。由图3 可知，没食子酸标准溶液与Folin-Ciocalteu 试剂在30 ℃条件下，避光反应，显色时间60 min 内，随着时间的延长，吸光度增大。当显色60 min 时体系吸光度达到最大。显色60 min 后，体系吸光度变化很小，表明显色反应基本完全，显色体系稳定性很好。因此，确定Folin-Ciocalteu 比色法的反应时间为60 min。

综上所述，确定Folin-Ciocalteu 比色法测定褐藻多酚含量的显色温度为30 ℃，显色时间为60 min。

图4 吸光度随Folin-Ciocalteu 试剂用量的变化Fig.4 The absorbance at different addition amounts of Folin-Ciocalteu reagent

3.3 Folin-Ciocalteu 显色剂和Na2CO3加入量的确定

Folin-Ciocalteu 显色剂的用量对显色效果具有较大影响，由图4 可知，Folin-Ciocalteu 试剂用量在0.75～1.75 mL 内，随着显色剂用量的增加，测得的吸光度增加;当Folin-Ciocalteu 试剂加入量为1.25 mL，吸光度达到最大，吸光值为0.707。当显色剂用量超过1.25 mL 后，吸光度略有下降。因此，确定Folin-Ciocalteu 试剂的加入量为1.25 mL。

图5 吸光度随10% Na2CO3溶液加入量的变化Fig.5 The absorbance at different addition amount of 10%Na2CO3solution

酚类化合物与Folin-Ciocalteu 试剂反应必须在碱性条件才可以显色，反应体系中Na2CO3溶液是显色的支持介质。由图5 可知:随着Na2CO3用量的增加，体系吸光度逐渐升高，当Na2CO3用量为4.0 mL 时，吸光度达到最大。但进一步增加Na2CO3溶液吸光度变化幅度不大，因此确定0.1 g/mL Na2CO3溶液的加入量为4.0 mL。

3.4 标准曲线的绘制

精密量取不同浓度的没食子酸工作液各1.0 mL，按照2.4 确定的最优比色条件绘制标准曲线，得线性回归方程为Y=0.0138X+0.0267，相关系数R2=0.9993。表明没食子酸质量浓度在15～50 μg/mL 范围内，与其吸光值呈良好的线性关系，符合朗伯-比尔定律，可用于铜藻中褐藻多酚的含量测定。

3.5 Folin-Ciocalteu 法测定褐藻中褐藻多酚的方法学评价

稳定性实验:对Folin-Ciocalteu 比色法测定的铜藻中的褐藻多酚进行稳定性实验，反应完全后在30℃下避光放置0、30、60、90、120 min 后测定吸光值，其吸光值分别为0.508、0.501、0.499、0.512、0.499，结果表明随着时间的延长，吸光度值略有下降，但幅度不大，相对标准偏差(RSD)为1.169%，表明120 min 内溶液稳定性良好。

精密度实验:对Folin-Ciocalteu 比色法测定的铜藻中的褐藻多酚进行精密度实验，同一样液测定5次，吸光值分别为0.487、0.491、0.510、0.497、0.497，其相对标准偏差(RSD)为1.754%，表明该方法具有较高的精密度，能够满足样液分析的要求。

重现性实验:对Folin-Ciocalteu 比色法测定的铜藻中的褐藻多酚进行重现性实验，取同一批铜藻样品5 份，各1.0 g，精密称定，按2.3 的方法，分别测定吸光度，吸光值分别为0.488、0.492、0.498、0.499、0.502，其相对标准偏差(RSD)1.145%，表明该方法具有良好的重现性。

加标回收率试验:按照2.6 的方法进行加标回收试验，由表1 可以看出采用Folin-Ciocalteu 比色法测定铜藻中褐藻多酚的加标试验中，回收率最高的为99.36%，最低为92.50%，平均回收率96.18%，其RSD 为2.44%。结果表明，该方法具有较高的准确性和可靠性，可以用于铜藻中褐藻多酚含量的测定。

3.6 铜藻中褐藻多酚的含量

按照2.7 中的方法测定铜藻中褐藻多酚的含量分别为17.44、17.58、17.08、17.18、17.51 mg/g，其平均含量为17.36 mg/g(RSD=1.25%)。

表1 加标回收率试验结果Table 1 Results of recovery experiment

4 结果与讨论

综上所述，考虑影响多酚含量测定的主要因素:检测波长、显色温度、显色时间、Folin-Ciocalteu 试剂和碱液用量，确定Folin-Ciocalteu 比色法测定铜藻中褐藻多酚含量的测定条件为:精密量取铜藻供品溶液1.0 mL，加水稀释，加1.25 mL Folin-Ciocalteu 试剂，混匀，3 min 后加入4.0 mL 0.1 g/mL Na2CO3溶液，加水定容至10 mL，混匀，30 ℃避光反应60 min，以试剂空白为对照，在760 nm 波长处测定吸光度。方法学实验证明该方法具有操作简单、精密度高、稳定性好、准确可靠等优点，可用于铜藻中褐藻多酚含量的测定。

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