黄连温胆汤对糖尿病合并脑梗死大鼠血糖、神经功能缺失及血管内皮生长因子表达的影响

王瑞 曹健 刘永惠 曹丽君 孙连庆▲

1.西安交通大学第一附属医院中医科，陕西西安710061；2.西安医学院生理学教研室，陕西西安710021

黄连温胆汤对糖尿病合并脑梗死大鼠血糖、神经功能缺失及血管内皮生长因子表达的影响

王瑞1曹健2刘永惠1曹丽君1孙连庆1▲

1.西安交通大学第一附属医院中医科，陕西西安710061；2.西安医学院生理学教研室，陕西西安710021

目的观察黄连温胆汤对糖尿病合并脑梗死大鼠血糖、神经功能缺失及血管内皮生长因子（VEGF）表达的影响及其可能的机制。方法选取清洁级成年SD大鼠72只，随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、黄连温胆汤大剂量组、黄连温胆汤中剂量组、黄连温胆汤小剂量组。糖尿病动物模型造模成功后，所有大鼠普通饲料喂养4周。除假手术组外，其余各组进行缺血性脑卒中模型复制（线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞模型），而假手术组只做分离不结扎。术后每天用青霉素腹腔注射以预防感染，连续3 d。造模成功后，黄连温胆汤大、中、小剂量组每天分别给予黄连温胆汤0.24、0.12、0.06 g/kg体重溶于2 mL生理盐水灌胃，1次/d；假手术组及模型组给予生理盐水灌胃2 mL/次，1次/d；阳性对照组每天给予血塞通6 mg/kg体重溶于2 mL生理盐水灌胃，1次/d。于糖尿病造模后72 h、造卒中模后与治疗14 d后各检测1次血糖，观察大鼠神经功能缺损情况，按酶联免疫吸附测定法检测大鼠脑组织内VEGF蛋白水平。结果与模型组比较，黄连温胆汤大、中、小剂量组以及阳性对照组均能显著降低大鼠血糖水平（P＜0.05或P＜0.01），减轻神经功能缺损症状（P＜0.05），降低大鼠脑组织VEGF含量（P＜0.05）；同时黄连温胆汤大、中、小剂量组在这些方面与阳性对照组之间差异无统计学意义（P＞0.05）。结论黄连温胆汤可调节VEGF，神经功能缺损的改善可能与VEGF含量的改变相关。

黄连温胆汤；糖尿病；脑梗死；血管内皮生长因子

糖尿病是脑梗死的重要危险因素之一。糖尿病脑梗死发病及病死率均是非糖尿病性脑血管病的2～4倍[1]。糖尿病合并脑梗死病机本虚标实，急性期以标实为主。黄连温胆汤出自清·陆廷珍所著《六因条辨》一书，主治痰热内扰、失眠、眩晕、心烦、口苦等症，由黄连、半夏、陈皮、茯苓、甘草、生姜、竹茹、枳实组成。临症若见痰湿内盛的多尿多饮多食者可用此辨证。本实验主要是研究黄连温胆汤对大鼠血糖、神经功能缺失及血管内皮生长因子（VEGF）的改善情况，为其临床应用提供科学的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

选用清洁级成年SD大鼠72只，清洁级大鼠，雌雄各半，体重250～300 g，由第四军医大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK（军）2010-005，给予大鼠标准颗粒饲料、自由饮水和自然昼夜节律光照。

1.1.2 药品

黄连温胆汤：西安交通大学第一附属医院药剂室生产提供，浓度为400 g生药/L。血塞通片：云南省玉溪市维和制药有限公司生产，批号：20130113。链尿佐菌素（STZ）：美国Sigma公司生产，NO：S0130。

1.1.3 仪器

100 mL量筒：西安市化学玻璃仪器厂。电子天平：上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂制造；型号FA1004N。其他：冰箱、电子天平、大鼠固定台、止血钳、手术刀、灌胃针、注射器、试管、纱布、持针器、手术剪刀等。

1.2 实验方法

1.2.1 动物分组及实验流程

大鼠适应性喂养1周后，随机分为假手术组、模型组、阳性对照组、黄连温胆汤大剂量组、黄连温胆汤中剂量组、黄连温胆汤小剂量组，每组12只。除假手术组每笼饲养5只外，其余各组均采用分养法，每笼饲养1只。禁食不禁水12 h后。除假手术组外，其他组均复制糖尿病动物模型，注射STZ 72 h后测大鼠尾静脉血糖。造糖尿病动物模型成功后，不进行治疗，所有大鼠普通饲料喂养4周。模型组、阳性对照组、黄连温胆汤大、中、小剂量组进行缺血性脑卒中模型复制[线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞（MCAO）模型]，假手术组只做分离不结扎。术后每天用青霉素40 000 U/只腹腔注射以预防感染，连用3 d。复合造模成功后治疗14 d，治疗前与末次治疗后测血糖1次。给药剂量：黄连温胆汤大剂量组每天给予黄连温胆汤0.24 g/kg体重溶于2 mL生理盐水灌胃，1次/d；黄连温胆汤中剂量组每天给予黄连温胆汤0.12 g/kg体重溶于2 mL生理盐水灌胃，1次/d；黄连温胆汤小剂量组每天给予黄连温胆汤0.06 g/kg体重溶于2 mL生理盐水灌胃，1次/d；假手术组及模型组给予生理盐水2 mL/次灌胃，1次/d。阳性对照组每天给予血塞通6 mg/kg体重溶于2 mL生理盐水灌胃，1次/d；动物处死，采用组间等位定位法[2]设定半暗带的等值区，所有动物均剥取缺血侧大脑距离嗅球尖端7～11 mm、大脑矢状裂至外侧裂上1/3皮质组织，液氮保存。

1.2.2 模型制备

1.2.2.1 糖尿病模型复制采用腹腔注射STZ制备糖尿病大鼠模型。禁食不禁水12 h后，室温条件下，大鼠称重后，用0.1 mol/L（pH 4.24）枸橼酸-枸橼酸钠缓冲溶液溶解STZ，配成2%的STZ溶液，按60 mg/kg给大鼠腹腔注射，注射3 d后采用尾静脉采血测定血糖，血糖达到11.1 mmol/L者判定为糖尿病大鼠，并饲养4周。实验过程中，糖尿病大鼠明显多尿、多饮、多食及体重下降，皮毛污秽无光泽，血糖波动在较高水平。假手术组不做糖尿病大鼠模型的制备。

1.2.2.2 糖尿病合并脑梗死模型复制在糖尿病模型基础上采用线栓法建立大鼠MCAO模型。糖尿病大鼠喂养4周后做脑梗死模型。术前12 h禁食不禁水，每组12只，参照Longa等[3]报道的线栓法建立大鼠MCAO模型。大鼠经10%的水合氯醛（10 mL/kg）腹腔麻醉后，仰卧固定，颈部正中切口分离并暴露右侧颈总动脉与颈外动脉，并在颈外动脉分叉处结扎颈外动脉，在近心端结扎颈总动脉。在颈总动脉近颈内、颈外分叉处剪一小口，将3 cm的渔线（直径0.205 mm）顺势缓慢进入，深度为（1.8±0.5）cm，在大脑中动脉起始端堵塞大脑中动脉的血流。然后将颈总动脉连同渔线一起结扎，缝合皮肤，放回笼中，自由喂养，选择苏醒后行走向左旋转或左侧肢体瘫痪的大鼠为栓堵成功者进行实验，否则视为失败，弃置不用。假手术组的手术过程与上相同，只是不做线栓。

1.2.2.3 造模成功标志本实验将糖尿病模型与脑梗死模型结合起来，建立糖尿病合并脑梗死动物模型。糖尿病造模后观察到大鼠即明显出现体重减轻，饮水量、进食量、尿量增加，皮毛污秽无光泽，血糖波动在较高水平即表示糖尿病动物模型成功。在糖尿病的基础上再建立脑梗死模型，大鼠不仅出现上述四量的改变，而且也出现神经功能的改变，即行走向左旋转或左侧肢体瘫痪的体征，则提示糖尿病合并脑梗死大鼠模型建立成功。

1.3 观察指标及评价标准

1.3.1 一般状况

每天观察各组大鼠的活动度、精神状况、毛色、进食、饮水、大小便情况，颈部切口是否有化脓；是否有死亡大鼠，记录死亡时间并做尸解以查明死因。

1.3.2 大鼠神经功能缺损评定

大鼠清醒后第4小时（未经药物治疗）、第24小时（药物治疗1 d）、第14天（药物治疗14 d后）用量化的分级方法评定神经功能缺损程度。按Garcia介绍的18分评分法：自发性活动；四肢活动的对称性；前肢伸展爬行动作的对称性；笼壁抓力；推躯干反应；触须反应。评价标准：0分：四肢或患肢无活动或反应；1分：有少许活动；2分：活动较正常差；3分：活动正常。总分最高18分，最低0分。

1.3.3 血糖测定

于糖尿病造模后72 h、造卒中模后与治疗14 d后各测血糖1次。

1.3.4 大鼠脑组织VEGF的测定

取脑分离出患侧半球放于冻存管置液氮中，检测前以生理盐水制成10%脑组织匀浆。取制备好的脑组织匀浆按照试剂盒说明操作检测大鼠脑组织内VEGF的表达。

1.4 统计学方法

应用SPSS 18.0统计软件进行统计学分析。计量资料以均数±标准差表示，组间均数比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

糖尿病合并脑梗死大鼠造模成功后，由于在糖尿病基础上造模，病情较重导致死亡，另一原因可能死在造脑梗死模型时，线栓插入过深使脑梗死面积过大导致死亡，排除死亡大鼠后，假手术组11只，模型组9只，阳性对照组9只，黄连温胆汤大剂量组9只，黄连温胆汤中剂量组11只，黄连温胆汤小剂量组10只。

2.1 各组大鼠血糖变化情况比较

造糖尿病模型后72 h，与假手术组比较，其余各组大鼠血糖均显著提高，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。造卒中模后，与假手术组比较，其余各组大鼠血糖明显升高（P＜0.05或P＜0.01）。治疗后14 d，与假手术组比较，其余各组大鼠血糖明显升高（P＜0.05或P＜0.01）；与模型组比较，黄连温胆汤大、中、小剂量组和阳性对照组均能显著降低大鼠血糖水平（P＜0.05或P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠血糖变化情况比较（mmol/L，）

表1 各组大鼠血糖变化情况比较（mmol/L，）

注：与假手术组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别只数造糖尿病模型后72 h造卒中模后治疗后14 d假手术组模型组阳性对照组黄连温胆汤大剂量组黄连温胆汤中剂量组黄连温胆汤小剂量组11 9 9 9 1 1 10 4.6±0.7 23.1±4.9▲▲21.8±3.5▲▲22.2±4.9▲▲21.2±5.3▲▲21.3±4.9▲▲5.4±0.6 24.0±4.2▲▲24.1±3.5▲24.1±4.3▲23.0±4.8▲23.2±4.3▲5.0±0.6 23.8±4.8▲▲23.1±3.2▲△17.3±3.7▲△△21.3±4.4▲△△22.7±4.2▲△

2.2 各组大鼠神经功能缺损评分比较

在大鼠清醒后第4小时，与假手术组比较，各组大鼠神经功能缺损评分均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。第24小时，与假手术组比较，各组大鼠神经功能缺损评分均显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，黄连温胆汤大、中剂量组和阳性对照组均能显著降低大鼠神经功能缺损评分（P＜0.05）。第14天，与假手术组比较，模型组大鼠神经功能缺损评分显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，黄连温胆汤大、中、小剂量组及阳性对照组神经功能缺损评分明显提高，差异有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较

表2 各组大鼠神经功能缺损评分比较

注：与假手术组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别只数第4小时第24小时第14天假手术组模型组阳性对照组黄连温胆汤大剂量组黄连温胆汤中剂量组黄连温胆汤小剂量组11 9 9 9 1 1 10 17.8±0.4 8.1±0.3▲8.4±0.3▲7.8±0.4▲7.9±0.4▲8.0±0.4▲17.8±0.3 10.2±0.3▲10.5±0.2▲△10.7±0.3▲△11.2±0.4▲△10.1±0.4▲17.8±0.4 10.2±0.4▲17.5±0.3△17.8±0.4△17.6±0.4△13.0±0.4△

2.3 各组大鼠脑组织中血管内皮生长因子含量比较

与假手术组及模型组比较，黄连温胆汤大、中、小剂量组和阳性对照组均能显著降低大鼠脑组织VEGF含量（P＜0.05）。见表3。

3 讨论

糖尿病是脑梗死重要危险因素之一，糖尿病患者血液黏度增高、红细胞聚集增强、血小板及凝血因子活化增多等可促进血管内血栓形成，易发生脑梗死[4]。研究表明，活血化瘀化痰中医药可有效改善脑微循环和改善脑细胞代谢，同时有降低血黏度、降血脂、抑制血小板聚集的作用[5]。黄连温胆汤主要由黄连、竹茹、枳实、半夏、橘红、甘草、生姜、茯苓组成。方中黄连清中焦湿热，清心除烦；半夏燥湿化痰，和胃止呕；竹茹清热化痰，清胃止呕；半夏、枳实理气化痰；茯苓健脾渗湿，宁心安神。诸药共奏清热化痰、健脾除湿之功，可用于治疗痰热内扰所致的糖尿病并发症[6]，能显著改善2型糖尿病小鼠的认知功能[7]，对急性脑梗死亦有一定疗效[8]。现代研究表明，黄连中有效成分小檗碱有降低体内胰岛血糖素水平、促进胰岛归细胞再生与功能恢复、抑制肝脏糖原异生、促进外周组织对葡萄糖的酵解等作用[9]；枳实可使胃肠蠕动增强；陈皮、半夏能减轻胃潴留，对胃肠道各种激素的分泌起调节作用[10]。黄连温胆汤有清热祛痰的功效，文献报道，有调节免疫的功能，能抑制血小板凝聚，增强心肌抗氧化和消除自由基[11]。

表3 各组大鼠脑组织中血管内皮生长因子含量比较（ng/L）

表3 各组大鼠脑组织中血管内皮生长因子含量比较（ng/L）

注：与假手术组比较，▲P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05

组别只数血管内皮生长因子假手术组模型组阳性对照组大剂量组中剂量组小剂量组11 9 9 9 1 1 10 28.5±5.2 45.6±6.2 18.2±6.3△▲17.9±5.3△▲16.8±7.8△▲15.6±5.1△▲

VEGF是一种作用于血管内皮细胞的多功能因子，是内皮细胞特异性的促有丝分裂素，能促进内皮细胞分裂、增殖和转移，它在血管生成的各个阶段均发挥着重要作用，是目前公认的血管新生中最关键的因子。它具有促进血管形成和增强神经保护及诱导脑屏障通透性增加和脑水肿形成的作用，后者理论上利于脑梗死后的继发出血[12]。有实验表明，VEGF在脑梗死发生后的增高可能是脑梗死急性期的自我保护机制之一。2型糖尿病患者由于长期高血糖引起VEGF水平上调并在一定程度上失去了应激性增高的能力，进而不能实现脑梗死急性期的血管新生和神经保护作用，这可能是2型糖尿病合并脑梗死患者病情重、预后差的原因之一[13]。

实验过程中，给予糖尿病合并脑梗死大鼠黄连温胆汤灌胃治疗，可有效降低血糖，明显改善神经功能缺损程度，有效降低脑梗死发生的概率。本实验在治疗14 d后测定大鼠脑组织VEGF的含量，其中假手术组VEGF有少量表达，模型组VEGF表达量增高，这可能是缺血性脑损伤诱导VEGF表达的缘故；应用黄连温胆汤干预后，VEGF降低，这可能和VEGF的动态表达有关，应在治疗中选择较多的时间点进行检测，进一步明确VEGF与糖尿病合并脑梗死的关系，根据目前实验结果可以推测，黄连温胆汤可调节VEGF，神经功能缺损的改善可能和VEGF含量的改变相关。

糖尿病合并脑梗死属于中医“消渴”“中风”范畴，本实验结果表明，给予糖尿病合并脑梗死大鼠黄连温胆汤灌胃治疗，可有效降低血糖，明显改善神经功能缺损，降低脑组织中VEGF含量，有效降低脑梗死发生的概率。中药在治疗糖尿病和脑梗死的作用机制十分复杂，其作用效果亦可能是多靶点作用的综合效应，黄连温胆汤治疗糖尿病合并脑梗死也可能通过不同的作用途径，有必要继续考察其对于糖尿病合并脑梗死其他作用机制的影响情况，如细胞凋亡、神经受体、神经免疫、内分泌及循环系统等方面的进一步研究。

[1]邹学彬.糖尿病性与非糖尿病性脑梗塞临床对照分析[J].西部医学，2006，18（6）：738.

[2]徐晓云，李刚.糖尿病脑梗死大鼠血管内皮生长因子及其受体表达水平的变化[J].临床神经病学杂志，2008，21（2）：126-128.

[3]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，etal.Reversible middle cerebradl artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stoke，1989，20（1）：84-91.

[4]朱天信，刘玉翠，杨阳，等.大蒜素对脑梗死的防治作用[J].吉林医药学院学报，2015，36（1）：63-64.

[5]韦桂梅，陈华振，郭丽泉，等.温胆汤加减对脑梗死急性期HCY、FIB、CRP的影响[J].中国中医急症，2014，23（7）：1264-1266.

[6]王永山.温胆汤治疗牺尿病并发症刍议[J].辽宁中医药大学学报，2009，11（4）：158-160.

[7]张卫华，张维新.黄连温胆汤对糖尿病小鼠海马神经凋亡的影响[J].山西中医学院学报，2012，13（3）：54-56.

[8]俞小芬，张春霞.黄连温胆汤加味治疗痰瘀阻络型急性脑梗死的临床观察[J].中医药学报，2013，41（4）：102-103.

[9]丁南南，童珊珊，丁丽霞，等.小檗碱的分析方法及药理作用研究进展[J].药物分析杂志，2012，7（31）：324-325.

[10]李乾构，王自立.中医胃肠病学[M].北京：中国医药科技出版社，1993：446-448.

[11]刘国胜，薛芳.温胆汤加减治疗冠·心病心绞痛60例[J].山东中医杂志，2004，23（6）：342-343.

[12]周广平，刘继新.SD大鼠急性脑梗死静脉溶栓后脑内VEGF的表达与出血性转化的关系[J].中外医学研究，2014，12（6）：152-153.

[13]李蕾，殷响，苏丹.2型糖尿病合并脑梗死患者血清血管内皮生长因子的临床分析[J].牡丹江医学院学报，2011，32（3）：45-46.

Effect of Huanglian Wendan Decoction on expression of blood glucose, neurological deficit and vascular endothelial growth factor of rats with diabetes mellitus and cerebral infarction

WANG Rui1CAO Jian2LIU Yonghui1CAO Lijun1SUN Lianqing1▲
1.Departmentof Traditional Chinese Medicine,the First Affiliated Hospitalof Xi'an Jiaotong University,Shaanxi Province, Xi'an 710061,China;2.Department of Physiology,Xi'an Medical College,Shaanxi Province,Xi'an 710021,China

ObjectiveTo observe the effect of Huanglian Wendan Decoction on expression of blood glucose,neurological deficit and vascular endothelial growth factor(VEGF)of rats with diabetes mellitus and cerebral infarction and its possible mechanism.Methods72 clean adult SD rats were chosen and randomly divided into sham operation group, model group,positive control group,Huanglian Wendan Decoction high dose group,Huanglian Wendan Decoction medium dose group,Huanglian Wendan Decoction low dose group.After the success building of animal models of diabetes mellitus,all rats were fed with normal diet for four weeks.In addition to the sham operation group,the other groups made replication of ischemic stroke model(suture-occluded method was used to establish middle cerebral artery occlusion model in rats),the sham operation group only took separation without ligation.Intraperitoneal injection of Penicillin every day after operation was used to prevent infection,for 3 days continuously.After the success building of model,Huanglian Wendan Decoction high,medium,low dose group was given Huanglian Wendan Decoction 0.24, 0.12,0.06 g/kg weight into 2 mL saline for gavage,once a day;the sham operation group and model group were given saline for gavage,once 2 mL;the positive control group was given Xuesaitong 6 mg/kg weight into 2 mL saline for gavage,once a day,The blood glucose was detected for one time respectively after the establishment of diabetes mellitus for 72 h,after the establishment of stroke model,and after treatment for 14 d.The conditions of neurologic impairment in rats were observed.The protein level of VEGF in brain tissue of rats was detected by enzyme-linked immunosorbent assay.ResultsCompared with model group, Huanglian Wendan Decoction high,medium,low dose group and positive control group could significantly de-crease the levels of blood sugar of rats(P＜0.05 orP＜0.01),reduce the symptoms of neurologic impairment(P＜0.05),lower the contents of VEGF in brain tissue of rats(P＜0.05);while Huanglian Wendan Decoction high,medium, low dose group had no significant differences compared with positive control group in the indexes above(P＞0.05).ConclusionHuanglian Wendan Decoction can adjust VEGF,and the improvement of neurologic impairment may be correlated with the changes of VEGF contents.

Huanglian Wendan Decoction;Diabetes mellitus;Cerebral infarction;Vascular endothelial growth factor

R587

A

1673-7210（2015）07（b）-0020-04

2015-02-02本文编辑：张瑜杰）

陕西省自然科学基金项目（2014JM4118）；陕西省中医管理局中医药科研项目（13-LC088）。

王瑞（1981-），女，硕士，主要从事老年病的中医药研究。

▲通讯作者