中药丹参对哮喘大鼠气道重塑及基质金属蛋白酶-9的影响

李玉卿 赵文娟 夏永辉 李彦 陈静

云南中医学院，云南昆明650500

中药丹参对哮喘大鼠气道重塑及基质金属蛋白酶-9的影响

李玉卿 赵文娟 夏永辉 李彦 陈静

云南中医学院，云南昆明650500

目的研究丹参对哮喘大鼠气道重塑和基质金属蛋白酶-9（MMP-9）含量的影响。方法将SPF级SD成年雄性大鼠70只随机分为正常对照组、哮喘模型组（哮喘2周组、哮喘4周组、哮喘8周组）、丹参干预组（丹参2周组、丹参4周组、丹参8周组）3个大组和7个小组。卵蛋白（OVA）-氢氧化铝混悬液致敏激发大鼠复制哮喘气道重塑模型，分别持续2、4、8周。观察哮喘大鼠肺组织病理形态变化，采用ELISA检测大鼠肺组织MMP-9含量。结果丹参能改善哮喘大鼠气道炎症细胞的浸润及支气管平滑肌的增厚。与正常对照组[（1.99±0.29）ng/mL]比较，哮喘4周组[（2.43±0.40）ng/mL]、哮喘8周组[（3.01±0.31）ng/mL]肺组织中MMP-9含量升高（P＜0.05、P＜0.01）；与哮喘2周组[（2.29±0.51）ng/mL]、哮喘4周组[（2.43±0.40）ng/mL]比较，哮喘8周组[（3.01±0.31）ng/mL]肺组织中MMP-9含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与哮喘8周组[（3.01±0.31）ng/mL]比较，丹参8周组[（2.10± 0.20）ng/mL]肺组织中MMP-9含量显著降低（P＜0.01）。结论丹参能够抑制哮喘大鼠肺组织MMP-9的分泌，改善哮喘大鼠气道重塑状态。

丹参；哮喘；气道重塑；基质金属蛋白酶-9

支气管哮喘（以下简称“哮喘”）是由多种细胞和细胞组分参与的气道慢性炎症性疾病。慢性炎症导致患者气道反应性增加，随病程延长导致气道不可逆狭窄和气道重塑。气道重塑是哮喘的一大重要病理学特征，其本质是气道纤维化和胶原沉积。气道重塑可加重气道高反应性，导致肺功能持续性、进行性损害，从而增加临床上哮喘的难治性[1]。

大量实验证实，活血化瘀中药可治疗和控制哮喘气道炎症及气道重塑。丹参是我国传统医药学中应用最早而且最广泛的活血化瘀药物之一，具有降低毛细血管通透性、改善微循环、保护肺功能、抗氧自由基、抗炎等作用[2]。近来也有实验表明，丹参可用于治疗哮喘。

基质金属蛋白酶-9（MMP-9）是降解细胞外基质（ECM）的主要成分，实验证实，MMP-9在哮喘小鼠肺组织的表达水平明显升高，在生理和病理情况下有利于组织重构[3]。MMP-9可作为一种显示气道组织破坏与修复情况的标志[4-5]。

本实验通过组织病理分析和酶联免疫吸附法（ELISA）检测哮喘大鼠气道重塑不同阶段及在不同阶段给予活血化瘀单味药丹参干预后的病理特征和肺组织中MMP-9的动态变化。为临床治疗和预防哮喘气道重塑用药最佳时机的选择及使用规律提供实验依据，并拓展中药丹参调节和改善哮喘气道重塑的新用途。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

SPF级SD成年雄性大鼠70只，4～6周龄，平均体重（180±20）g，购自四川省医学科学院实验动物研究所，许可证号：SCXK（川）2013-24，合格证号：0018160，实验动物随机分成正常对照组、哮喘模型组（分为哮喘2周组、哮喘4周组、哮喘8周组）、丹参干预组（分为丹参2周组、丹参4周组、丹参8周组）共计3个大组，7个小组。依据分组不同分笼饲养，可以自由进食去卵清蛋白（包括鸡蛋）的饲料和水，常规饲养于云南中医学院实验动物中心层流架。

1.2 药物及制备

中药丹参购自昆明福林堂药业有限公司，使用前水煎3次后浓缩成含生药1 g/mL的混悬液。

1.3 试剂及仪器设备

卵清蛋白（OVA）、氢氧化铝凝胶（美国Sigma公司）；大鼠MMP-9 ELISA试剂盒（苏州卡尔文生物科技有限公司）。

大鼠雾化箱（有机玻璃，自制，大小：45 cm×35 cm× 20 cm）；压缩雾化器（PARI BOYN08，德国百瑞有限公司）；电子天平（AR124CN型，美国奥豪斯）；离心机（德国Eppendorf公司）；轮转式切片机、组织烘/摊片机（德国Leica）；显微镜（日本Olympus）；酶标仪（美国分子仪器公司）；超纯水系统（美国Millipore公司）等。

1.4 气道重塑模型的建立

哮喘大鼠气道重塑模型是在哮喘大鼠模型的基础上延长激发时间而建立的[6-7]。哮喘模型组、丹参干预组第1天和第14天腹腔注射OVA-氢氧化铝混悬液2 mL致敏（OVA 1 mg，氢氧化铝100 mg，加生理盐水至2 mL），于实验第21天起将大鼠置于密闭容器内，予2%OVA生理盐水雾化激发，30 min/次，隔天1次，哮喘2周组及丹参2周组，哮喘4周组及丹参4周组，哮喘8周组及丹参8周组持续时间分别为2、4、8周，正常对照组用生理盐水代替OVA致敏和激发。实验中观察大鼠反应，出现烦躁不安、呼吸急促深快、腹肌抽搐、烦躁呛咳及点头运动等症状表明建立哮喘模型成功[8-10]。

1.5 药物干预试验

每次用药前丹参水煎冷却备用。每次激发前30 min对实验动物进行腹腔注射给药：正常对照组和哮喘模型组注射无菌蒸馏水，丹参干预组注射丹参水煎剂。注射剂量根据成人（60 kg）临床一日用药量按动物体表面积等效剂量换算出大鼠（200 g）等效用药量。

1.6 取材及检测方法

1.6.1 大鼠肺组织病理检测各组大鼠末次激发后24 h，打开胸腔取下左肺组织，中性甲醛固定，石蜡包埋后切片，苏木精-伊红（HE）染色光学显微镜下观察细支气管、血管及肺泡的病理改变。

1.6.2 大鼠肺组织MMP-9检测取各组大鼠右肺组织500 mg，加入生理盐水1 mL，组织匀浆器充分研磨，离心取上清0.1 mL，加生理盐水至1 mL，充分混匀后，再次离心后取上清液备测。采用ELISA检测试剂盒测定上清液MMP-9含量，操作步骤参照试剂盒说明书进行，通过标准品吸光度（A）值绘制标准曲线，然后计算各样本MMP-9含量。

1.7 统计学方法

采用SPSS 16.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差表示，采用方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠支气管肺组织病理学改变

正常对照组：大鼠肺组织未见炎症细胞浸润，支气管管腔规则，气道黏膜上皮及肺泡结构完整，肺泡间隔窄，气道平滑肌薄，肺泡腔透亮，无上皮脱落损伤，黏膜无水肿（图1A）。哮喘模型组：2周组支气管可见黏液栓，气道有损伤，肺泡间隔不同程度增宽，部分断裂，气管与血管周围有炎症细胞浸润（图1B）；4周组可见杯状细胞增生，基底膜增厚，肺泡间隔不同程度增宽，轻度充血水肿，气管周围炎症细胞浸润（图1C）；8周组大量密集炎症细胞浸润，可见黏液栓，肺泡融合、不同程度断裂，平滑肌增生（图1D）。丹参干预组：2周组支气管较规则，炎症细胞浸润减少（图1E）；4周组增生细胞减少，肺泡大小相似，充血、水肿减轻，少量炎症细胞浸润（图1F）；8周组支气管管壁趋于正常，上皮结构较完整，管壁未见增厚，浸润的炎症细胞减少，无明显炎性渗出（图1G）。

2.2 各组大鼠肺组织中MMP-9含量比较

与正常对照组比较，哮喘2周组肺组织中MMP-9含量有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05），而哮喘4、8周组肺组织中MMP-9含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05、P＜0.01）；与哮喘2周组比较，丹参2周组肺组织中MMP-9含量有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），而哮喘8周组肺组织中MMP-9含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与哮喘4周组比较，丹参4周组肺组织中MMP-9含量有所降低，但差异无统计学意义（P＞0.05），而哮喘8周组肺组织中MMP-9含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；与哮喘8周组比较，丹参8周组肺组织中MMP-9含量显著降低，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见表1。

表1 各组大鼠肺组织中MMP-9含量比较（ng/mL，)

表1 各组大鼠肺组织中MMP-9含量比较（ng/mL，)

注：与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与哮喘2周组比较，△P＜0.05；与哮喘4周组比较，▲P＜0.05；与哮喘8周组比较，▽P＜0.01；MMP-9：基质金属蛋白酶-9

组别只数MMP-9正常对照组哮喘2周组哮喘4周组哮喘8周组丹参2周组丹参4周组丹参8周组10 9 7 7 8 7 7 1.99±0.29 2.29±0.51 2.43±0.40*3.01±0.31**△▲1.93±0.30 2.06±0.49 2.10±0.20▽

3 讨论

近年来有效改善气道重塑成为哮喘防治的新方向，国内关于哮喘气道重塑研究成为哮喘研究中的亮点。西药以糖皮质激素的研究为主，但糖皮质激素能否抑制哮喘气道重塑仍存在争议[11-12]。此外，糖皮质激素的众多副作用一直使其极富争议性。

中医药注重“整体调节，扶正固本，平衡阴阳”的总原则，对哮喘气道重塑有良好的治疗效果[13]。大多数中医医家都认同，在不同证型的纤维化中，瘀血是重要病理产物。因此，活血化瘀是治疗器官纤维化的大法[14]。王文建等[6]、张力江等[15]均证实川芎嗪、蓝玉簪颗粒（主要成分为藏药蓝玉簪龙胆和三七总皂苷）等活血化瘀中药可以有效减轻哮喘气道重塑。丹参具有抗纤维化、抗菌、抗病毒、免疫调节等作用，可通过这些作用多靶点、多层次干预气道重塑的形成，有效地改善或阻断哮喘大鼠气道重塑。其机制可能如下：①活血化瘀，对抗氧自由基，改善微循环，有利于及时清除气道上的炎性因子及免疫复合物；②调节免疫功能，既可促进单核-巨噬细胞的吞噬作用，加快清除免疫复合物，又可通过抑制相应器官组织中炎性因子的含量抑制免疫反应对靶器官的损伤；③抑制成纤维细胞增殖或诱导成纤维细胞凋亡，减少胶原合成和分泌[16]；④抑制血小板聚集与活化[17]。本实验证实丹参对抗哮喘气道炎症及气道重塑均有一定作用，它能减轻哮喘气道重塑已形成的各种结构改变，包括气道壁上皮层增厚、上皮下胶原沉积及平滑肌层增厚及炎症细胞浸润。

MMP-9是特异性降解ECM的锌依赖性蛋白酶家族，在气道重塑中起重要作用。作为与哮喘气道重塑关系最为密切的基质金属蛋白酶，MMP-9主要负责降解ECM，在哮喘状态下，MMP-9的过度表达不仅能导致ECM结构重塑，而且能诱导嗜酸粒细胞迁移并影响气道平滑肌细胞增殖与迁移，进而诱发哮喘气道重塑，因此抑制MMP-9表达已被认为是改善哮喘气道重塑的重要机制之一[18]。本实验提示，丹参可以降低哮喘气道重塑大鼠肺组织中MMP-9的表达，起到改善哮喘气道重塑的作用。从药物作用时间来看，8周干预效果为佳。

同时，本实验结果提示，在哮喘大鼠模型（以OVA-氢氧化铝混悬液致敏激发大鼠）的基础上延长激发时间可以建立哮喘气道重塑模型，持续作用2周以上大鼠即可出现不同程度气道重塑的表现，随激发时间延长，气道重塑越明显，从效果来看，造模持续作用时间以8周为佳。

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Effects of Salvia Miltiorrhiza on airway remodeling and MMP-9 in rats with asthma

LI Yuqing ZHAO Wenjuan XIA Yonghui LI Yan CHEN Jing
Yunnan University of Traditional Chinese Medicine,Yunnan Province,Kunming 650500,China

ObjectiveTo study the effects of Salvia Miltiorrhiza on airway remodeling and matrix metalloproteinase-9 (MMP-9)in rats with asthma.MethodsSeventy SPF male adult SD rats were randomly divided into normal control group,asthma model group(asthmatic two-weeks group,asthmatic four-weeks group and asthmatic eight-weeks group), Salvia Miltiorrhiza intervention group(Salvia Miltiorrhiza two-weeks group,Salvia Miltiorrhiza four-weeks group and Salvia Miltiorrhiza eight-weeks group).Ovalbumin(OVA)-hydroxide suspension was applied to stimulate the remodeling of asthmatic airway in rats,for 2,4,8 weeks respectively.The pathological changes on the lung tissue of asthmatic rats were observed,ELISA was used to detect the level of MMP-9 in lung tissue of rats.ResultsThe results indicated that Salvia Miltiorrhiza improved infiltration of airways inflammatory cells and thickening of bronchial smooth muscle cells in asthmatic rats.Compared with normal control group[(1.99±0.29)ng/mL],the content of MMP-9 in lung tissue of asthmatic four weeks-group[(2.43±0.40)ng/mL]and asthmatic eight-weeks group[(3.01±0.31)ng/mL]increased(P＜0.05,P＜0.01);compared with asthmatic two-weeks group[(2.29±0.51)ng/mL],asthmatic four-weeks group[(2.43± 0.40)ng/mL],the content of MMP-9 in lung tissue of asthmatic eight-weeks group[(3.01±0.31)ng/mL]increased(P＜0.05);compared with asthmatic eight weeks-group[(3.01±0.31)ng/mL],the content of MMP-9 in lung tissue of Salvia Miltiorrhiza eight-weeks group[(2.10±0.20)ng/mL]decreased significantly(P＜0.01).ConclusionSalvia Miltiorrhiza can inhibit the secretion of MMP-9 in lung tissue of asthmatic rats,improve the state of airway remodeling in asthmatic rats.

Salvia Miltiorrhiza;Bronchial asthma;Airway remodeling;Matrix metalloproteinases-9

R965

A

1673-7210（2015）07（b）-0012-04

2015-04-15本文编辑：李亚聪）

云南省教育厅科学研究基金项目（2013Y241）；云南省应用基础研究项目（2014FZ088）。

李玉卿（1979.4-），女，天津人，昆明医科大学生物化学与分子生物学专业在读硕士研究生；研究方向：中医药在生物学中的应用；专业擅长：基础医学实验研究。

陈静（1978.8-），女，上海人，硕士；研究方向：病原生物学与免疫学；专业擅长：病原生物学与免疫学科研及教学。