参芎化瘀胶囊对全脑缺血大鼠海马区Notch1/GAP-43 表达的影响

周 娜 赵雅宁 李建民

1.华北理工大学护理与康复学院，河北唐山 063000；2.华北理工大学附属医院神经外科，河北唐山 063000

参芎化瘀胶囊对全脑缺血大鼠海马区Notch1/GAP-43 表达的影响

周 娜1赵雅宁1李建民2

1.华北理工大学护理与康复学院，河北唐山 063000；2.华北理工大学附属医院神经外科，河北唐山 063000

目的探讨参芎化瘀胶囊对全脑缺血再灌注大鼠海马区 Notch1/GAP-43 表达的影响。方法将 100 只健康雄性 SD 大鼠随机分为假手术组（n = 25）、脑缺血再灌注组（n = 25）、参芎化瘀胶囊低剂量组（n = 25）以及高剂量组（n = 25）。 参芎化瘀胶囊低剂量组以及高剂量组灌胃剂量为 240、480 mg/（kg·d），假手术组和脑缺血再灌注组按10 mL/kg 体重给予蒸馏水，早上 8∶00 给药，每日 1 次，连续 7 d。 运用改良的 Pulsineli 4 血管阻断（4-VO）法进行全脑缺血再灌注模型的制作，分别于 1、2、3、7、14 d 断头处死取海马组织，HE 染色观察海马细胞形态变化，免疫组化法检测 Notch1、GAP-43 的表达。 造模后 1～3 d 采用横木行走实验评价大鼠感觉运动功能。结果与假手术组比较，脑缺血再灌注组海马区正常神经元计数明显减少，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），Notch1（术后 1、2、3 d）、GAP-43（术后 3、7、14 d）表达均增多，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），横木行走实验评分明显减少（P ＜ 0.05）；与脑缺血再灌注组比较，参芎化瘀胶囊低剂量组正常神经元计数增多，Notch1、GAP-43 蛋白明显增多（P ＜ 0.05），横木行走实验评分明显提高（P ＜ 0.05）。 参芎化瘀胶囊高剂量组上述各指标变化表现得更加明显（P ＜ 0.05）。 脑缺血再灌注组和参芎化瘀胶囊低剂量组中 Notch1 和 GAP-43 表达均呈正相关（r = 0.838，P ＜ 0.01；r = 0.786，P ＜0.01）。结论参芎化瘀胶囊可能通过 Notch1/GAP-43 通路对全脑缺血大鼠起神经保护作用。

全脑缺血；参芎化瘀胶囊；Notch1；GAP-43

参芎化瘀胶囊中含有多味中草药，有通络化瘀、益气养血、疗伤定通的功效，有研究表明此药对脑有 保护 作 用[1-3]， 但具体机制尚不明确。 Notch1 是 Notch通路的一个受体蛋白，其能精确调控多种细胞的增殖、分化和凋亡。 有研究提示[4-5]，Notch1 对缺血损伤后的神经发生以及脑的功能恢复具有重要作用。 GAP-43是特异性表达于哺乳动物神经系统上的生长相 关 蛋白，当脑神 经损伤 时，GAP-43 表 达的增 高 是内源性神经再生过程中的一个特征，它可以作为神经元发育生长、神经再生以及成熟中枢神经系统中突触重建和可塑性的标志物[6]。 本实验运用四血管堵塞方法建立全脑缺血模型，对脑损伤的大鼠 施予高、低剂量的中药参芎化瘀胶囊，目的是观察各组大鼠海马区神经元结构，同时从 Notch1/GAP-43 角度来探讨参芎化瘀胶囊对脑缺血的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

100 只健康成年雄性 SD（Sprague-Dawley）大鼠，体重 250～300 g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号：SCXK（京）2010-0013，喂养在华北理工大学动物实验室中，室温在（24±2）℃，自然光照射。 将实验动物按随机数字表法分为四组：假手术组（25 只）、脑缺血再灌注组（25 只）、参芎化瘀胶囊低剂量组（25 只）、参芎化瘀胶囊高剂量组（25 只）。除假手术组外，其余三组均将大鼠造模成全脑缺血 15 min。

1.2 药物

参芎化瘀胶囊主要是由中草药川芎、人参、石菖蒲、紫河车、龙血竭等多种成分组成的复方制剂，由华北理工大学附属医院研制，其生产批号为 Z20051586。

1.3 试剂和仪器

Rabbit Anti-GA P43、Rabbit Anti-Notch1 多 克 隆抗体（北京博奥森公司），浓缩型 DAB 试剂盒（北京中杉金桥生物公司），PV-6001 一步法聚合物检测系统（北京中杉金桥生物公司），石蜡切片机（德国 LEICA），显微 镜 （日 本 Olympus Ixto），恒温摊 片 烤 片机（TK-218型，湖北泰维科技实业有限公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备 SD 大鼠全脑缺血再灌注模型采用Pulsineli 4 血管阻断（4-VO）法[7]：用 10%水合氯醛溶液给大鼠腹腔麻醉（35 mg/100 g 体重），分离双侧颈总动脉，在其下置线备用，电凝针热凝第一颈椎横突翼孔，2～4 s/次，以达到双侧翼小孔下的椎动脉永久闭塞。 为防止大鼠互相撕咬，术后大鼠要分笼饲养，一鼠一笼。24 h 后，使大鼠保持非麻醉状态，用无创微动脉夹将大鼠双侧颈总动脉夹闭 15 min，然后释放，使其再灌注。 术中保持大鼠肛温在（37.0±0.5）℃。 假手术组分离并暴露颈总动脉，但不夹闭，也不电凝椎动脉。 全脑缺血模型成功：颈总夹闭 30～60 s 内大鼠处于昏迷状态，瞳孔变大，眼睛颜色变白，呼吸急促，动脉夹松开20～30 s，大鼠意识恢复，眼睛颜色恢复红色，可活动。

1.4.2 给药 参芎化瘀胶囊溶于蒸馏水，48 g/L，参芎化瘀胶囊低、高剂量组按照 240、480 mg/（kg·d）灌胃给药，假手术组和脑缺血再灌注组按 10 mL/kg 体重给予蒸馏水，在造模之前 7 d 开始每天早上 8∶00 灌胃给药 1 次，第 7 天给药 1 h 后进行水合氯醛麻醉，而后行全脑缺血再灌注，术后继续给药至各自时间点。

1.4.3 行为学检测 实验大鼠于造模前 4 d 做横木行走实验（beam walking test，BWT）[8]，每天 1 h，直至能熟练完成横木行走为止， 造模成功后 1～3 d 重新评分，评定大鼠感觉运动功能水平。 横木长 1200 mm， 直径25 mm，放置在距离地面 700 mm 的地方。 一端放置一个黑木盒子，另一端应用声光等刺激诱导实验大鼠通过横木进入木盒。评分等级分为 0～6 分，其中，不能站立，立即掉下的计为 0 分；不能前进，但能够站在横木上的计为 1 分；在前进中掉下的计为 2 分；能到达终点，但受累一侧肢体在前进中不起作用的计为 3 分；能到达终点，但有大于一半的路程中出现脚滑现象的计为 4 分；能到达终点，少量脚滑现象的计为 5 分；能到达终点，无脚滑现象的计为 6 分。

1.4.4 HE 染色 脑组织灌注后在 4%多聚甲醛溶液中固定 24 h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（切片厚度5 μm，载玻片经泡酸、涂 1∶4 多聚赖氨酸处理），切好的组织切片在 60℃烤箱烘烤 24 h 后，二甲苯Ⅰ、Ⅱ脱蜡，递减的浓度梯度酒精脱水，苏木精染色，1%盐酸酒精分化，流水冲洗返蓝，0.5%伊红复染，80%、95%、100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。 200 倍光镜随机观察脑组织海马 CA1 区不重叠的 6 个视野， 并摄片，进行统计分析。

1.4.5 免疫组化检测 采用一步法聚合物检测系统行免疫组化：脑组织灌注后在 4%多聚甲醛溶液中固定24 h，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片（切片厚度 5 μm，载玻片经泡酸、涂 1∶4 多聚赖氨酸处理），切好的组织切片在 60℃烤箱烘烤 24 h 后，二甲苯脱蜡，酒精脱水，水化组织切片，柠檬酸盐缓冲液高压修复，3%H2O2孵育以阻断内源性过氧化物酶，分别滴加 GAP-43 和Notch1 一抗（GAP-43 和 Notch1 浓度分别为 1∶300 和1∶150），4℃冰箱过夜，滴加二抗，37℃孵育 50～60 min，然后 DAB 显色，随时在显微镜下观察着色情况，及时终止染色，苏木精复染，最后脱水、透明封片。 400 倍光镜下，计数每组标本 4 个不重复视野中的阳性细胞，计算平均值。

1.5 统计学方法

应用 SPSS 13.0 统计软件建立数据库，计量资料数据以均数±标准差表示。 各组间比较应用单因素方差分析和 Pearson 相关分析，以 P ＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对行为学的影响

假手术组没有出现感觉运动功能受损的现象。 与假手术组比较，脑缺血再灌注组前期时间点（1～3 d）感 觉 运 动 功 能 明 显 受 损 ， 差 异 有 统 计 学 意 义 （P ＜ 0.05）；与脑缺血再灌注组比较，参芎化瘀胶囊低剂量组在对应时间点（1～3 d）感觉运动功能明显改善，差异有统计学意义（P ＜ 0.05），且参芎化瘀胶囊高剂量组改善更明显（P ＜ 0.05）。 见表 1。

表1 各组大鼠横木行走实验评分比较

表1 各组大鼠横木行走实验评分比较

注：与假手术组比较，*P ＜ 0.05；与脑缺血再灌注组比较，△P ＜ 0.05；与参芎化瘀胶囊低剂量组比较，▲P ＜ 0.05

组别 只数1d2d3d假手 术组脑缺 血再 灌注组参芎 化瘀 胶囊低 剂 量组参芎 化瘀 胶囊高 剂 量组25 25 25 25 6.00±0.00 1.20±0.45*2.20±0.45*△3.20±0.44*△▲6.00±0.00 2.20±0.45*3.20±0.45*△4.20±0.45*△▲6.00±0.00 2.40±0.55*3.80±0.84*△5.00±0.70*△▲

2.2 对大鼠海马 CA1 神经元影响

假手术组海马神经元结构完整，数量多，核圆、大，细胞排列紧密；脑缺血再灌注组1d 细胞水肿明显，出现大量红色神经元，染色深，核固缩，细胞变形，正常神经元数量减少；3 d 神经元排列紊乱，部分细胞排列疏松，细胞核皱缩，深染，周围出现空泡，神经元结构不清，正常神经元的数量也有减少；7 d 正常神经元数量进一步减少，细胞间的空泡区域增多明显；14 d见许多细胞溶解后残留的痕迹，细胞稀疏，排列紊乱。与假手术组比较，脑缺血再灌注组各时间点存活的神经细胞数量减少，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；与脑缺血再灌注组比较，参芎化瘀胶囊低剂量组神经元变性坏死情况减轻，结构完整的神经元较多（P ＜ 0.05），参芎化瘀胶囊高剂量组上述变化更明显（P ＜ 0.05）。见表 2。

表2 各组大鼠海马区存活的正常神经元计数比较

表2 各组大鼠海马区存活的正常神经元计数比较

注：与假手术组比较，*P ＜ 0.05；与脑缺血再灌注组比较，△P ＜ 0.05；与参芎化瘀胶囊低剂量组比较，▲P ＜ 0.05

组别 只数1d 2d 3d 7d 14d假手术组脑缺血再 灌注组参芎化瘀 胶囊低 剂量 组参芎化瘀 胶囊高 剂量 组25 25 25 25 189.50±1.37 23.34±4.28*28.94±3.25*△3 4.44±2.97*△▲188.90±1.36 19.34±2.14*25.82±3.01*△32.28±4.11*△▲189.46±1.28 15 .64±1 .16*20.61±3.19*△29.62±3.39*△▲188.98±1.32 15.20±1.90*18.98±4.60*△39.00±5.39*△▲189.45±1.35 18.56±1.95*24.60±4.50*△46.80±2.17*△▲

2.3 对海马 CA1 区 Notch1、GAP-43 阳性表达的影响2.3.1 Notch1 免疫组化 Notch1 主要表达在细胞胞浆中。 假手术组海马神经元的 Notch1 阳性表达不明显。 与假手术组比较，Notch1 在脑缺血再灌注组相对应时间点的阳性表达明显增加，差异有统计学意义（P ＜0.05）；与脑缺血再灌注组比较，参芎化瘀胶囊低剂量组相对应时间点 Notch1 的阳性表达明显增多， 且染色更深（P ＜ 0.05），参芎化瘀胶囊高剂量组上述变化更明显（P ＜ 0.05）。 见表 3、图 1（封四）。

表3 各组大鼠海马区 Notch1 阳性细胞数量比较

表3 各组大鼠海马区 Notch1 阳性细胞数量比较

注：与假手术组比较，*P ＜ 0.05；与脑缺血再灌注组比较，△P ＜ 0.05；与参芎化瘀胶囊低剂量组比较，▲P ＜ 0.05

组别 只数1d2d3d假手 术组脑缺 血再 灌注组参芎 化瘀 胶囊低 剂 量组参芎 化瘀 胶囊高 剂 量组25 25 25 25 2.48±1.34 6.3 6±1.38*8.80±1.37*△10.23±1.36*△▲2.47±1.30 7.90±1.55*9.84±1.50*△12.48±1.58*△▲2.50±1.35 1 0.6 9±1.52*12.60±1.53*△14.72±1.52*△▲

2.3.2 GAP-43 免疫组化 GAP-43 的阳性染色为棕黄色，阳性表达定位于细胞胞浆和胞膜。 假手术组大鼠海马神经元 GAP-43 染色未见明显阳性表达；与假手术组 比 较， 脑 缺血 再灌 注 组 3、7、14 d 表 达 逐渐 增高，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）；与脑缺血再灌注组比较，参芎化瘀胶囊低剂量组相对应时间点阳性表达均升高，神经元细胞胞浆淡黄色着色加深，阳性细胞数增多，各时间点差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。 参芎化瘀胶囊高剂量组上述变化更明显（P ＜ 0.05）。 见表 4、图 2（封四）。

表4 各组大鼠海马区 GAP-43 阳性细胞数量比较

表4 各组大鼠海马区 GAP-43 阳性细胞数量比较

注：与假手术组比较，*P ＜ 0.05；与脑缺血再灌注组比较，△P ＜ 0.05；与参芎化瘀胶囊低剂量组比较，▲P ＜ 0.05

组别 只数3d 7d 14d假手术组脑缺血再灌注组参芎化瘀胶囊低剂量组参芎化瘀胶囊高剂量组25 25 25 25 0.25±0.42 10.49±5.42*13.45±4.80*△15.37±4.63*△▲0.24±0.40 11.12±5.94*14.36±4.91*△18.00±4.27*△▲0.27±0.38 16.24±8.22*18.59±4.84*△21.90±13.28*△▲

2.4 Notch1 和 GAP-43 表达的相关分析

相关分析显示，脑缺血再灌注组 Notch1 和 GAP-43呈正相关（r = 0.838，P ＜ 0.01）；参芎化瘀胶囊低剂量组、高剂量组 Notch1 和 GAP-43 均呈正相关（r = 0.786，P ＜ 0.01；r = 0.816，P ＜ 0.01）。

3 讨论

从本研究行为学及 HE 染色形态学的观察中发现参芎化瘀胶囊低剂量组行为学评分以及大鼠海马CA1 区正常神经元计数都明显高于脑缺血再灌注组，并且这些指标的变化在参芎化瘀胶囊高剂量组中有突出表现，说明中药参芎化瘀胶囊在缺血性脑损伤中是有神经保护作用的，它可以减少再灌注后神经元的死亡数，同时促进感觉运动功能的恢复。 这与刘斌等[9]研究是一致的。

哺 乳 动 物 体 内 Notch 家 族 有 Notch1 ～4 四 种 受体。 Notch1 蛋白持续存在于成年动物的神经系统中[10]。研究表明[11]，Notch 信号通路可促进脑缺血损伤后的血管新生和神经修复，抑制神经细胞凋亡。 陈丽等[12]对大鼠进行缺血预处理，结果发现缺血预处理可升高Notch1 及其相关蛋白的表达，同时梗死体积百分比减少，神经功能损伤评分降低，提示缺血预处理可能通过 Notch 通路对损伤神经有修复作用。 Felling 等[13]研究认为围生期缺血缺氧可造成新生儿神经系统损伤，在损伤组织内 Notch1 蛋白表达水平明显升高，此时神经干细胞（NSCs）大量增加，表明 Notch1 蛋白的表达促进了 NSCs 的增殖。 从而推测 Notch1 可能为神经系统损伤后促进神经修复的主要靶蛋白。 Notch 信号通路促进神经修复的机制涉及调控 mTOR、PI3K/Akt、ROCK2 等 29 个不同的基因功能[14]。 Notch 信号可以激活放射状神经胶质和体外的多能神经干细胞，它是星形神经胶质发育所必需的。 由此认为 Notch 信号在神经修复与再生过程中有着重要地位[15]。 生长相关蛋白 43（GAP-43）在神经组织细胞中广泛表达，可促进神经元的生长、发育、轴突再生及突触重建，直接参与神经的损伤后修复[16-17]。 GAP-43 被列为研究神经可塑性的首选探针[18]，是神经修复的重要标志蛋白。 本研究截取 GAP-43 这一神经修复标志性蛋白，认为通过 Notch1 调控 GAP-43，对损伤神经进行修复作用。本研究结果显示，参芎化瘀胶囊低剂量组中 Notch1、GAP-43 的阳 性 表达数量 比 脑 缺血再 灌 注 组 有所 增加，并且在参芎化瘀胶囊高剂量组中阳性表达数增加的幅度更加明显。 同时，统计学分析显示 GAP-43 表达与 Notch1 呈正相关（r = 0.816，P ＜ 0.01）。神经修复进程在神经元受到损伤各期均有，本研究分别选取缺血早期和后期对两种蛋白进行检测。 各组中 Notch1 在缺血早期（1～3 d）变化，GAP-43 随之有相应的变化趋势，且参芎化瘀胶囊以高低不同剂量调节着两个因子的变化。 结合两种剂量的参芎化瘀胶囊对缺血大鼠神经元的调节及其他实验结果，笔者推测参芎化瘀胶囊很可能是通过 Notch1 通 路 对 GAP-43 起 作 用 ， 进 而对损伤神经元进行修复。

综上所述，参芎化瘀胶囊有益气养血、通络化瘀的疗效，本实验从激活 Notch1 信号通路、活化 GAP-43蛋白参与神经再生和功能修复的角度阐明参芎化瘀胶囊对脑缺血的作用，但二者之间具体联系机制有待进一步研究。

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Influence on the expression of Notch1/GAP -43 after global cerebral ischemia-reperfusion in hippocampus by Shenxiong Huayu Capsules

ZHOU Na1ZHAO Y aning1LI Jianmin2
1.Institute of Nursing and Rehabilitation,North China University of Science and Technology,Hebei Province,Tangshan 063000, China; 2.Department of Neurosurgery, the Affiliated Hospital of North China University of Science and Technology,Hebei Province,Tangshan 063000,China

ObjectiveTo investigate the effect of Shenxiong Huayu Capsules on the expression of Notch1/GAP-43 after global cerebral ischemia reperfusion in hippocampus.MethodsOne hundred healthy male SD rats were randomly divided into 4 groups:sham operation group (n = 25),cerebral ischemia reperfusion group (n = 25) and Shenxiong Huayu Capsules low-dose group (n = 25) and high-dose group (n = 25). The gavage dose of Shenxiong Huayu Capsules lowdose group and high-dose group was 240, 480 mg/(kg·d), the sham operation group and cerebral ischemia reperfusion group were given distilled water according to 10 mL/kg weight, once every 8∶00 am, for 7 days. The model of global cerebral ischemia reperfusion was made by improved four-vessel occlusion according to Pulsinelli 4 vascular occlusion (4-VO) method, and the rats were sacrificed at 1, 2, 3, 7 d and 14 d respectively after injury to take the hippocampus tissues. HE staining was used to detect morphological changes in hippocampus each point in time; and the expressions of Notch1 (1, 2, 3 d) and GAP-43 (3, 7, 14 d) were measured by immunohistochemistry. The sensorimotor functions of the rats were detected by beam walking teston 1-3 days after injury.ResultsCompared with sham operation group,the neuron counts ofrats in cerebral ischemia reperfusion group was significantly decreased (P ＜ 0.05).The expressions of Notch1 (1-3 days after injury) and GAP-43 (3,7, 14 d after injury) in cerebral ischemia reperfusion group were enhanced obviously at the corresponding time (P ＜ 0.05),and the scores of beam walking test were decreased obviously in cerebral ischemia reperfusion group (P ＜ 0.05).Compared with cerebral ischemia reperfusion group,the neuron counts were decreased obviously in Shenxiong Huayu Capsule low-dose group (P ＜ 0.05),the expressions ofNotch1 and GAP-43 were further increased in Shenxiong Huayu Capsules low-dose group (P ＜ 0.05), and the scores of beam walking test improved significantly in Shenxiong Huayu Capsules low-dose group (P ＜ 0.05).The above indexes mentioned changes were more noteworthy in Shenxiong Huayu Capsules high-dose group (P ＜ 0.05). The expressions between Notch1 and GAP-43 had a positive correlation with each other in cerebral ischemia reperfusion group and Shenxiong Huayu Capsules low-dose group (r = 0.838, P ＜ 0.01; r = 0.786, P ＜ 0.01).ConclusionThe neuroprotective effect of Shenxiong Huayu Capsules on cerebral ischemia reperfusion injury rats may be related to Notch1/GAP-43 pathway.

Global cerebral ischemia;Shenxiong Huayu Capsules;Notch1;GAP-43

R743.3

A

1673-7210（2015）08（b）-0008-05

2015-03-27 本文编辑：张瑜杰）

河北省自然科学基金资助项目（H2012401007）。

赵雅 宁 （1974-），女 ，副教 授 ，医学博士 ；研究方向：脑保护。