中药木瓜中总糖及还原糖的含量测定

薛丹 黄奋奋 姚风艳 孙连娜

1.第二军医大学药学院，上海200433；2.福建中医药大学药学院，福建福州350108

中药木瓜中总糖及还原糖的含量测定

薛丹1黄奋奋1姚风艳2孙连娜1

1.第二军医大学药学院，上海200433；2.福建中医药大学药学院，福建福州350108

目的建立中药木瓜药材中总糖及还原糖的测定方法并对其含量进行测定，由此计算推测出药材中多糖含量。方法采用苯酚-浓硫酸法测定总糖含量，采用3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）测定还原糖的含量。结果木瓜总糖含量为12.06%。DNS法测定还原糖的最佳条件为：测定波长560 nm，DNS最佳用量为5.0 mL，沸水浴加热5 min。测得药材中还原糖含量为11.58%。木瓜原药材中多糖含量为2.51%。结论苯酚浓硫酸法及DNS法可用于总糖及还原糖含量的测定，总糖和还原糖含量的高低在一定程度上可以反映多糖含量的多少。

中药木瓜；总糖；还原糖；苯酚-浓硫酸法；3，5-二硝基水杨酸法；含量测定

木瓜为蔷薇科木瓜属皱皮木瓜[Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai]的干燥近成熟果实，有舒筋活络、和胃化湿之功效。用于湿痹拘挛、腰膝关节酸重疼痛、转筋挛痛等症状[1]。木瓜全身是宝，营养成分较高，木瓜皮、花、枝、核和根都可开发利用。木瓜具有抗氧化、抗病毒、抗氧化、抗菌、抗腹泻等[2-7]。木瓜是我国传统中药中药食同源的优良产品。近年来，多糖作为一种生物活性大分子物质，引起人们的广泛关注。多糖的含量不能直接测得，总糖含量减去还原糖含量即为多糖含量[8-11]。有文献采用苯酚浓硫酸法测定木瓜总糖含量[12]。目前，关于木瓜还原糖的含量测定报道较少且木瓜中还原糖含量测定的方法学考察也鲜有报道。还原糖的测定方法有多种[13]，本实验采用苯酚浓硫酸法及3，5-二硝基水杨酸法（DNS法）建立木瓜原药材中总糖和还原糖的测定方法，并对其含量进行测定。在此基础上用总糖减去还原糖含量即可得到多糖含量，为木瓜多糖的质量评价及开发利用提供一定的理论参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器

电热恒温水浴锅（上海精宏实验设备有限公司）；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9145A型）；循环水式多用真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；SENCO旋转蒸发仪（上海申生科技有限公司）；PTHW型电热套（河南豫华仪器有限公司）；LXJ-Ⅱ型离心沉淀机（上海医用分析仪器厂）；UV-5500PC型紫外可见分光光度计（上海元析仪器有限公司）；电子分析天平（上海精密科学仪器有限公司）。

1.2 实验试剂

葡萄糖（分析纯，生工生物）；3，5-二硝基水杨酸（Adamas Reagent Co.，Ltd）；酒石酸钾钠四水合物（分析纯，Shanghai Titanchem Co.，Ltd）；亚硫酸钠（国药集团化学试剂有限公司）；氢氧化钠（国药集团化学试剂有限公司）；无水乙醇（分析纯，江苏强盛功能化学股份有限公司）；95%乙醇（分析纯，上海道君精细化工有限公司）。中药木瓜药材购于第二军医大学附属医院上海长征医院制剂室，经第二军医大学药学院生药学教研室张汉明教授鉴定为皱皮木瓜Chaenomeles speciosa（Sweet）Nakai的干燥成熟果实。标本存于本实验室。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备

中药木瓜药材室温晾干后，粉碎，过4号筛，称取150 g，按液固比20∶1，即3000 mL水，在100℃沸水中回流提取3 h，放冷，纱布过滤。滤渣再次加入3000 mL水，沸水回流提取3 h，同样方法重复提取2次。合并滤液，定容至1000 mL，作为测定总糖及还原糖的供试品溶液。

2.2 葡萄糖对照品溶液的制备

精密称取烘干至恒重的葡萄糖对照品0.9984 g，以蒸馏水定容至1000 mL，配制成0.9984 g/L葡萄糖标准溶液。

2.3 6%苯酚溶液的配制

取适量苯酚，常压蒸馏，收集180℃馏分。再精密称取馏分80 g于100 mL容量瓶中，加蒸馏水溶解至刻度。即得80%苯酚，保存于4℃冰箱备用。6%苯酚由80%苯酚现用现配。

2.4 DNS试剂的配制

A液：水煮沸10 min冷却后，称取6.3 g DNS，21.0 g氢氧化钠充分溶解于500 mL水中。B液：称取182.0 g酒石酸钾钠溶解于500 mL热水中，再加入5.0 g苯酚，5.0 g亚硫酸钠，搅拌溶解。再将A液与B液混合均匀，定容至1000 mL棕色容量瓶中，于4℃冰箱中放置7 d[14]。

2.5 标准曲线的绘制

2.5.1 总糖测定标准曲线精密移取0.9984 g/L的葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于试管中，分别补蒸馏水至2.0 mL。以2.0 mL蒸馏水作空白对照，分别精密加入6%苯酚1.0 mL，摇匀后立即加入浓硫酸5.0 mL，摇匀，70℃水浴中加热20 min后冷却10 min，于490 nm处检测吸光度。以吸光度（A）为横坐标，浓度（C）为纵坐标，得到线性回归方程：C=0.0622 A+ 0.0006，r=0.9990。结果表明，葡萄糖浓度在0.009 58～0.057 48 g/L之间与吸光度呈良好的线性关系。

图1 葡萄糖标准曲线

2.5.2 还原糖测定标准曲线精密移取0.9984 g/L的葡萄糖标准液0.3、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5、1.8、2.0 mL于试管中，分别补蒸馏水至2.0 mL。混匀后加入DNS 5.0 mL，沸水浴加热5 min，冰水冷却后至室温后定容至25 mL。以蒸馏水为空白，于560 nm处测定吸光度，每组测定3次，取平均值。以葡萄糖浓度（C）为横坐标，吸光度（A）为纵坐标做图，得到标准曲线回归方程：A=11.818C-0.019，r=0.9993。结果表明，葡萄糖浓度在0.012～0.080 g/L之间与吸光度呈良好的线性关系。见图2。

图2 DNS法测定还原糖中葡萄糖标准曲线

2.6 测定条件的优化考察

2.6.1 显色条件的优化中药木瓜中总糖的含量测定多采用苯酚浓硫酸法[12]，本实验采用6%苯酚1.0 mL、浓硫酸5.0 mL，沸水浴15 min，冷却至室温后于490 nm处测定吸光度值。而还原糖的显色条件差异较大，故本实验主要对中药木瓜还原糖的最佳测定条件进行考察[10]。

2.6.2 DNS最佳吸收波长的确定分别于葡萄糖标准溶液、木瓜水提液、醇沉后的粗多糖液加入5.0 mL DNS试剂，沸水浴加热5 min，放置20 min后在450～650 nm处扫描吸收光谱。由图3～5可知，以DNS试剂为空白，还原产物在500 nm波长处有最大吸收，但吸收值为负值。而以DNS试剂为空白，在560 nm处可降低显色剂的影响，最佳的工作波长为560 nm。以蒸馏水为空白，在560 nm处吸光度空白吸收不影响还原糖的测定。考虑到DNS试剂的稳定性因素，选择以蒸馏水为空白，选取560 nm作为测定波长。

图3 不同浓度葡萄糖标准液、木瓜药材水提液与醇沉后多糖的波长扫描（以3，5-二硝基水杨酸为空白）

图4 不同浓度葡萄糖标准液的波长扫描（以水为空白）

图5 木瓜提取液与醇沉后多糖吸收波长的扫描（以水为空白）

2.6.3 沸水浴加热时间的确定精密移取0.9984 g/L葡萄糖标准液0.5 mL及蒸馏水1.5 mL于试管中，分别加入5.0 mL DNS试剂，沸水浴加热1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30 min，冰水冷却至室温后定容至25 mL，以蒸馏水为空白，于560 nm处测定吸光度。由图6可知，随着加热时间增大，吸光度值随之增大，在加热时间为4 min时吸光度达到最大，之后维持稳定，显色反应基本完成。从反应完全及节省时间考虑选择沸水浴加热时间为5 min。

图6 沸水浴加热时间对吸光度值的影响

2.6.4 DNS用量的确定精密移取0.9984 g/L的葡萄糖标准溶液0.5 mL及蒸馏水1.5 mL于试管中，分别加入0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、6.0、6.5、7.0 mL DNS试剂，沸水浴加热15 min，冰水冷却至室温后定容至25 mL容量瓶。以蒸馏水为空白，于560 nm处测定吸光度值。测得结果见图7，吸光度随着显色剂用量的增加而增加，DNS用量在5.0 mL时吸光度基本趋于稳定。考虑到能耗与成本，因此确定DNS的最佳用量为5.0 mL。

图7 3，5-二硝基水杨酸试剂用量对吸光度值的影响

2.7 方法学考察

2.7.1 精密度试验分别精密移取0.9984 g/L的葡萄糖标准液1.0 mL及1.0 mL蒸馏水于试管中，混匀后分别加入DNS试剂5.0 mL，沸水浴加热5 min，冰水冷却，以蒸馏水为空白于560 nm处测定吸光度。日内吸光度为0.198、0.200、0.201、0.198、0.198、0.196，n= 6，RSD=1.76%。日间精密度为0.203、0.201、0.202，n= 3，RSD=0.10%。提示仪器性能良好，操作准确可靠。

2.7.2 还原产物的稳定性试验精密移取葡萄糖标准溶液1.0 mL，加入1.0 mL蒸馏水及DNS试剂5.0 mL，沸水浴加热5 min后冰水冷却定容至25 mL。分别放置10、20、30、40、50、60 min。以蒸馏水为空白，于560 nm处吸光度为0.198、0.201、0.198、0.201、0.203、0.203，n=6，RSD=0.23%。实验结果表明，显色后60 min，吸光度值波动稳定。

2.7.3 还原糖加样回收试验精密移取已知还原糖含量为0.3596 g/L 1.0 mL的样品，按还原糖含量的80%、100%和120%精密加入葡萄糖标准溶液，混匀后加入DNS试剂5.0 mL，沸水浴加热5 min，冷却后定容至25 mL，以蒸馏水为空白，于560 nm处测定吸光度。结果显示，还原糖平均加样回收率为99.03%，符合要求。见表1。

表1 还原糖加样回收试验

2.8 木瓜还原糖的测定

采用已建立的测定方法，测定总糖及还原糖含量。根据标准曲线，采用苯酚浓硫酸法测得木瓜药材中总糖为14.09%，采用DNS法测得木瓜药材中还原糖为11.58%，中药木瓜药材中多糖含量为2.51%。

3 讨论

还原糖是具有还原性的糖，主要含有游离醛基及游离酮基，在碱性条件下加热被氧化成糖酸，DNS被还原成棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，在一定范围内，还原糖的量与颜色深浅成正比。所有的单糖和大部分双糖都是还原糖。本实验中还原糖的波长扫描采用了以蒸馏水和DNS试剂为空白，在最大吸收波长处，空白都有吸收，而在空白吸收最小时，还原糖的测定波长为560 nm。本实验中采用以蒸馏水为空白，减少了因DNS试剂配制过程中的操作误差，从而保证测定结果的稳定性。

通过吸收波长、显色时间及显色剂用量等影响还原糖测定的因素进行实验考察，确定了木瓜还原糖含量测定的最佳波长为560 nm，沸水浴显色时间5 min， DNS试剂用量为5 mL。

多糖是皱皮木瓜的有效成分之一，目前多糖无法直接测定。总糖与还原糖的多少在一定程度上反映了多糖的含量。本实验采用苯酚浓硫酸测定总糖含量，采用DNS测定还原糖含量，两者之差即为多糖含量。多糖是聚合结构，不含醛基，不是还原糖。DNS法测得的为还原糖的含量，避免了单糖、双糖、低聚糖及还原性物质对多糖测定的干扰，使得多糖的测得结果更加接近准确可靠。本实验测得中药木瓜药材中多糖含量为2.51%。

作为药食两用的传统果实部分药材，含有还原糖[16]。常见的还原糖有葡萄糖、果糖、乳糖、半乳糖、麦芽糖、甘露三糖。单糖是碳水化合物中最基本的单位，是不能水解的糖类，无需消化就可直接吸收与利用，因此用单糖补充热能比双糖及多糖效果更快。本研究为中药木瓜中多糖成分的提取分析、质量评价提供新的参考，为进一步的研究开发利用中药木瓜提供理论依据。

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Determination of total sugar and reducing sugar in Chaenomeles speciosa

XUEDan1HUANGDoudou1YAOFengyan2SUNLianna1
1.Department of Pharmacy,the Second Military Medical University,Shanghai 200433,China;2.Department of Pharmacy,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fujian Province,Fuzhou 350108,China

ObjectiveTo establish a method for determination of total sugar and reducing sugar in Chaenomeles speciosa and to detect the content of sugar with the methods.MethodsThe content of total sugar was determined by phenol-sulfuric acid method.The concentration of reducing sugar was determined by 3,5-dinitrosalicylic acid method.ResultsThe content of total sugar in Chaenomeles speciosa was 12.06%.The optimum determination wavelength of DNS colorimetry was 560 nm.The proper volume of DNS sample was 5.0 mL.The best time for colour reaction in the condition of boiling water bath was kept for 5 min.The content of reducing sugar in Chaenomeles speciosa was 11.58%.The content of polysaccharides was 2.51%.ConclusionPhenol-sulfuric acid method and DNS method can be used for the determination of total sugar and reducing sugar.The content of total sugar and reducing sugar indicate the content of polysaccharides in some degree.

Chaenomeles speciosa;Total sugar;Reducing sugar;Phenol-sulfuric acid method;3,5-dinitrosalicylic acid method;Determination of content

R284.1

A

1673-7210（2015）04（c）-0121-05

2015-01-12本文编辑：卫轲）

国家科技重大专项-重大新药创制（编号2011ZX 09102-006）。

薛丹（1988.8-），女，第二军医大学2012级生药学专业在读硕士研究生；研究方向：中药有效成分的提取分离及鉴定。

孙连娜（1973.9-），女，博士，教授；研究方向：中药鉴定与品质评价。