鲤科疱疹病毒2型 Taqman实时荧光PCR方法的建立

于 力，王津津，史秀杰，郑晓聪，贾 鹏，兰文升，刘 荭

（深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045）

鲤科疱疹病毒2型 Taqman实时荧光PCR方法的建立

于 力，王津津，史秀杰，郑晓聪，贾 鹏，兰文升，刘 荭

（深圳出入境检验检疫局动植物检验检疫技术中心，广东深圳 518045）

本研究针对鲤科疱疹病毒2型（CyHV-2）的主要衣壳蛋白基因，设计了特异性引物和Taqman探针，建立了实时荧光PCR方法。其检测下限为83拷贝，标准曲线R2＞0.998，且经比对，灵敏度与现行方法相当。选取了健康异育银鲫、金鱼、鲤鱼以及常见4种水生DNA病毒以及7种水生环境细菌进行特异性实验，结果均无交叉反应。重复性实验显示，2份独立的15次重复结果变异系数均小于2%，说明本方法重复性好。本方法能作为目前CyHV-2疫病检测方法的有效补充，对该病的防控具有重要的意义。

CyHV-2；实时荧光PCR；Taqman；异育银鲫；金鱼

鲤科疱疹病毒2型（CyHV-2）是从鲤科鱼类分离的第二种疱疹病毒。CyHV-2的核衣壳呈六角形或球形，直径为100～110nm，有囊膜的病毒粒子呈椭圆形，直径为175～200nm[1]。该病毒对金鱼和鲫鱼有很高的致病性，死亡率几乎可达100%。在日本、美国、澳大利亚、英国和中国都发生过该病发生[2-8]，对观赏鱼养殖业造成巨大冲击，引起经济损失。目前还没有针对CyHV-2的疫苗，因此及早的诊断对防控本病非常重要。

细胞分离技术是重要的检测方法。锦鲤鳍细胞KF-1，金鱼鳍细胞GFF等细胞系虽能产生细胞病变，但随着病毒代数的增加，病变逐渐不明显，甚至消失[9-10]。分子生物学检测方法是应用广泛的方法，也是最灵敏的方法，目前现有的分子生物学方法主要有普通PCR[6]以及实时荧光PCR[11]，分别针对病毒的解旋酶和DNA聚合酶基因。本研究针对CyHV-2的主要衣壳蛋白MCP基因，设计了Taqman荧光PCR引物，建立了实时荧光PCR方法，具有良好的灵敏度、特异性与重复性。

1 材料与方法

1.1 样品、病毒和细菌

感染CyHV-2的异育银鲫（Carassius auratus gibelio）样品于2011年9月从我国中部地区养殖场收集而来，水温21–25℃；健康异育银鲫、金鱼（Carassius auratus auratus）和鲤鱼（Cyprinus Carpio）样品来自我国中部地区，经现有方法[6，11]检测为CyHV-2阴性。

流行性造血器官坏死病毒（EHNV）澳大利亚参考株由澳大利亚动物卫生实验室赠送。锦鲤疱疹病毒（KHV）20100202、甲鱼虹彩病毒（STIV）9701、真鲷虹彩病毒（RSIV）20140706由本实验室分离保存。

金黄色葡萄球菌Staphyloccocus aureus（IAM1011）购自东京大学应用微生物研究所（IAM）；嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophilia（ATCC19570）、单增李斯特氏菌Listeria monocytogenes（ATCC13932）购自美国标准菌株保藏中心（ATCC）；温和气单胞菌A. sobria（20010836）、阴沟肠杆菌Enterobacter cloacae（20010243）、副溶血弧菌Vibrio Parahemolyticus（20090853）、创伤弧菌V. vulni ficus（20080191）由本实验室分离保存。

1.2 引物设计与合成

根据GenBank上的CyHV-2序列基因，对比分析后选取保守区域MCP基因ORF92（Genbank ID：14011329）设计引物。使用软件Oligo 7设计出荧光PCR引物和探针，其产物大小为100bp'。

正向引物MCP-rtF：5'-AAGCGATCCCGAGACTCTTG-3'，

反向引物MCP-rtR：5'-TATTGCATGATGCGGGTGAA-3'，

探 针 MCP-rtP：5'-FAM-CTGCTGACCGATCCATGCGGC-BHQ1-3'。

同时，针对荧光PCR扩增位点，设计了普通PCR引物以制备阳性质粒，扩增产物为477bp。

MCP-F：5'-AAACTCATCTGCACCGAGTCCC-3'，

MCP-R：5'-CCAAGACCATCTGACGGTGCT-3'。

所有引物探针均由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3 DNA提取

将从病鱼、健康异育银鲫、金鱼和鲤鱼采集的脑、脾与肾混合匀浆后进行核酸抽提。本实验用到的组织与病毒悬液均使用QIAamp DNA Mini QIA-cube Kit进行DNA提取。细菌则涂布平板后挑取单菌落，用ddH2O重悬至浊度达到1.0麦氏标准，100℃水浴加热10min，12000rpm离心10min，取上清液作为核酸模板。

1.4 实时荧光PCR

使用Platinum qPCR Super-mix UDG（Life Technology）试剂盒，按照试剂盒说明配制反应体系，引物终浓度为400nM，探针终浓度为200nM，程序为：50℃ 2min，95℃ 2min，40个循环（95℃ 15s，60℃ 45s）。使用ABI 7500 real time PCR system进行荧光PCR扩增。

1.5 MCP基因目标片段质粒的构建

根据1.2使用普通PCR引物，扩增出477bp产物。将普通PCR产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，切取目的大小亮带，使用MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit（Takara）试剂盒回收。连接到pMD18-T载体上，转化到感受态大肠杆菌DH5α，涂布到含氨苄青霉素的LB平板上，37℃培养过夜。挑取单克隆，经PCR鉴定为阳性质粒携带菌株后，用含氨苄青霉素的LB液体培养基培养过夜，使用MiniBEST Plasmid Puri fication Kit（Takara）试剂盒纯化质粒，PCR鉴定并送华大基因测序。确定目标片段成功插入后，用分光光度计测定核酸含量，并根据质粒的分子量计算质粒浓度。

1.6 特异性试验

将KHV、STIV、EHNV、RSIV、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、阴沟肠杆菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、单增李斯特氏菌进行实时荧光PCR实验，并设置阴性对照健康异育银鲫、金鱼与鲤鱼组织核酸和空白对照。

1.7 灵敏性试验

将纯化好的质粒按照10倍梯度稀释，进行实时荧光PCR灵敏性实验，并绘制标准曲线。同时，取适量病鱼组织提取病毒核酸，用分光光度计测定含量，再按照10倍梯度稀释，将现行荧光PCR方法[11]与本实验设计MCP方法的检测灵敏度进行比较。

1.8 重复性试验

选取2份独立的CyHV-2阳性组织样品核酸（命名为CyHV-2A和CyHV-2B），分别进行15次重复实时荧光PCR。选取健康的异育银鲫、金鱼和鲤鱼核酸样品各1份，分别进行5次重复实时荧光PCR。统计其Ct值平均值，标准差以及变异系数。

2 结果

2.1 特异性试验

实时荧光PCR特异性试验结果见图1，用感染CyHV-2异育银鲫提取的DNA有典型S型扩增，而阴性对照健康异育银鲫、金鱼和鲤鱼组织DNA，空白对照，以及KHV、STIV、EHNV、RSIV、金黄色葡萄球菌、嗜水气单胞菌、温和气单胞菌、阴沟肠杆菌、副溶血弧菌、创伤弧菌、单增李斯特氏菌均未见有扩增，可见上述方法特异性良好。

图1 实时荧光PCR特异性试验结果

2.2 灵敏性试验

构建MCP基因目标片段质粒，将纯化好的质粒作10倍梯度稀释，取质粒拷贝数8.3×107-8.3×101拷贝的梯度，进行荧光PCR。结果表明，实时荧光PCR的检测下限为8.3×101拷贝（图2），标准曲线R2＞0.998（图3），说明拟合直线与实验数据高度一致。将现行荧光PCR方法[11]与本实验设计MCP方法的检测灵敏度进行比较，试验数据见表1。本试验设计MCP方法在每个病毒核酸量梯度的标准差均小于现行方法，说明本MCP方法结果比较稳定，且在2.845×10-4ng病毒核酸梯度时，本MCP方法3个平行均检出，而现行方法仅有1个孔检出。

图2 实时荧光PCR检测下限实验结果

图3 实时荧光PCR标准曲线

表1 本试验设计MCP方法与现行荧光PCR方法[11]的检测灵敏度进行比较

表2实时荧光PCR重复性实验结果

2.3 重复性实验

阴性样品健康异育银鲫、金鱼和鲤鱼核酸的所有平行均为未检出，阳性样品结果见表2，2份阳性组织样品的标准差小于0.3，变异系数小于2%。

3 讨论

主要衣壳蛋白MCP是疱疹病毒的重要结构，参与病毒复制过程，且高度保守[12]。因此本试验选取MCP基因ORF92，设计了实时荧光PCR。经过一系列筛选与优化，最终确定了1组实时荧光PCR引物。实时荧光PCR的检测下限为83拷贝，与现行荧光PCR方法[11]属于同一个数量级。使用从阳性组织样品中提取的核酸进行两种方法的比对，本试验设计MCP方法对于低核酸含量样品具有更理想的检出率，同时结果的标准差也比较小，稳定性较好。实时荧光PCR标准曲线R2＞0.998，说明拟合直线与试验数据高度一致。

本试验选择健康异育银鲫、金鱼和鲤鱼组织，常见的4种水生DNA病毒以及7种水生环境细菌进行特异性实验。异育银鲫和金鱼是CyHV-2最主要的宿主[1，12]，而鲤鱼是鲤科鱼类的重要成员。在4种水生DNA病毒中，KHV是鲤疱疹病毒3型（CyHV-3），与CyHV-2基因相近[12-14]。7种水生环境细菌都是水生环境中较为常见的细菌，由于采样时常常会带有池水及其水体环境中的细菌，且荧光PCR较为灵敏，因此比较容易干扰试验结果。而特异性试验结果均无交叉反应，说明该实时荧光PCR方法特异性理想。

重复性试验结果中，2份独立的15次重复结果变异系数均小于2%，说明本方法重复性理想[15]。而 3份阴性样品重复试验，也验证了本方法的特异性。

Goodwin等所建立的现行荧光PCR[11]，针对DNA聚合酶基因。而本试验针对的是MCP基因，这能与现行方法形成很好的补充，结合使用能提高检测的准确性。同时，本试验在灵敏性和特异性检验方面做得更全面。首先，在灵敏性试验中，Goodwin等的文章使用的是目标基因的质粒，与实际检测情况会有差别，因为还会含有宿主、病毒全基因组等影响因素，本试验同时使用质粒和阳性组织进行灵敏性计算，结果会更加全面。其次，在特异性试验中，本试验使用了3种鲤科鱼、4种DNA病毒和7种水生细菌的核酸进行验证，而Goodwin等的文章仅使用了鲤疱疹病毒的其他型。

本研究的不足是在于没有使用鲤疱疹病毒1型（CyHV-1）进行特异性试验，但相信这不会对实际检测造成影响，原因如下：（1）CyHV-1主要感染鲤鱼，而CyHV-2主要感染金鱼和鲫鱼[12]，因此检测金鱼和鲫鱼时不太可能受CyHV-1的干扰；（2）CyHV-1的临床症状明显，主要在体表和鳍条出现肿瘤状病变[16]，而CyHV-2无此典型症状；（3）将荧光PCR引物探针序列在NCBI BLAST上进行比对，结果未见有CyHV-1，说明引物与CyHV-1序列不匹配，出现交叉反应的可能性很小。

综上所述，本研究建立了针对CyHV-2的实时荧光PCR方法，具备良好的灵敏度、特异性和重复性。本方法能作为目前CyHV-2疫病检测方法的有效补充，对该病的防控具有重要意义。

Establishment of Taqman Real-time PCR for Cyprinid Herpesvirus 2

Yu Li，Wang Jinjin，Shi Xiujie，Zheng Xiaocong，Jia Peng，Lan Wensheng，Liu Hong
（Shenzhen Exit-entry Inspection and Quarantine Bureau，Shenzhen，Guangdong 518045）

Primers and Taqman probe targeting major capsid protein of cyprinid herpesvirus 2（CyHV-2）were designed and a real-time PCR method was established. The lower limit of detection was 83 copies，and standard curve R2＞0.998.Comparison experiments showed that the sensitivity of this method was of same level as existing method. HealthyCarassius auratus gibelio，Carassius auratus auratus，Cyprinus Carpio，4 aquatic viruses and 7 aquatic bacteria were included for specificity tests，no cross reaction was observed. Repeatability tests showed that both coefficients of variation of independent result repeated 15 times were smaller than 2%，suggesting that the repeatability of this method was ideal. The established method would be supplementary to the existing CyHV-2 detection methods，and was of important significance for disease control.

CyHV-2；real-time PCR；Taqman；Carassius auratus gibelio；Carassius auratus auratus

S851.34

A

1005-944X（2015）10-0080-05

国家质检总局科技计划项目（2013IK043和2014IK236）

刘 荭

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胡藕祥）