宁夏地区鸡群新城疫流行率横断面调查

刘华雷，郑东霞，吕 燕，王静静，赵云玲，戈胜强，王晓亮，李知新，张学军，王福江，门生宝，王志亮

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 宁夏动物疫病预防控制中心，宁夏银川 750002；3. 中卫市动物疾病预防控制中心，宁夏中卫 755000；4. 沙坡头区动物疾病预防控制中心，宁夏中卫 755000）

宁夏地区鸡群新城疫流行率横断面调查

刘华雷1，郑东霞1，吕 燕1，王静静1，赵云玲1，戈胜强1，王晓亮2，李知新2，张学军2，王福江3，门生宝4，王志亮1

（1. 中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；2. 宁夏动物疫病预防控制中心，宁夏银川 750002；3. 中卫市动物疾病预防控制中心，宁夏中卫 755000；4. 沙坡头区动物疾病预防控制中心，宁夏中卫 755000）

新城疫在国内很多地区已经成为一种地方流行性疫病。为了解新城疫在宁夏地区的流行情况，采用横断面研究方法对该地区的新城疫场间流行率进行了测定。基于随机抽样的策略选择120个养鸡场进行抽样和问卷调查，并采用病毒分离结合序列测定的方式对采集的样品进行检测分析。结果表明该地区新城疫的流行率为5.83%（95% CI 1.64%～10.03%）。遗传进化分析表明，所有分离到的病毒均属于基因VII型，与2006年该地区流行的新城疫病毒相比，病毒已发生明显的变异。

新城疫；流行率；横断面调查；基因VII型；调查；分离与鉴定

新城疫是由新城疫病毒强毒株引起的、可严重危害养禽业的一种烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告疫病，我国农业部将新城疫列为一类动物疫病。在《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》中，新城疫被列为优先防控的重大动物疫病之一[1]。自20世纪80年代以来，我国对新城疫采取了全面免疫的防控策略，成效显著，全国报告新城疫疫情发生次数逐年下降，国家新城疫参考实验室主动监测的数据也表明新城疫强毒感染场点阳性率呈下降趋势[2]。在中长期规划中，确定了到2020年全国新城疫要达到控制标准。近年来随着疫苗质量的不断提高、养殖从业人员素质的不断提高和规模化养禽场生物安全水平的不断提高，使得中长期规划中确定的全国新城疫阶段性防控目标成为可能。但不能忽视的是，新城疫仍然是危害我国养禽业的重要疫病，在某些地区仍然持续存在，个别地区呈地方性流行，在临床上还出现了宿主范围扩大、免疫带毒现象普遍等新的流行特征。此外，国内开展的基于风险的主动监测表明，基因VI型和基因VIId型新城疫病毒是导致我国目前新城疫流行的主要优势基因型，但在个别地区也出现了一些新的基因型，如基因XII型和基因VIIh亚型等[3-4]。因此，新城疫防控形势依然不容乐观。

宁夏中卫市沙坡头区位于宁夏回族自治区西南部、黄河前套，是我国北方蛋鸡的主产区之一，是宁夏的养禽密集地，存栏量占全省1/3以上。家禽饲养以蛋鸡为主，以农户适度规模化和园区集约化养殖为特征，局部地区养殖密度极高，加上生物安全管理水平低，疫病流行较为复杂，疫病防控难度大。该地区曾在1999年首次发生H9N2亚型禽流感，2005年暴发过新城疫[5]，2006年和2012年曾先后暴发H5N1亚型高致病性禽流感[6]。因此，在该地区开展流行学研究具有重要意义，一方面可以开展早期预警、避免疫情扩散，另一方面也可以摸清该地区疫病流行现状，为防控决策提供依据。为此，我们在宁夏中卫市沙坡头区开展了新城疫流行率的横断面调查。

1 材料与方法

1.1 调查范围和抽样框

中卫市沙坡头区养禽区主要分布在东园、柔远、文昌、宣和、永康、镇罗、滨河、常乐和迎水桥9个乡镇。本次调查以该地区2013年春防时免疫档案记录的615户鸡养殖户作为抽样框进行调查，养殖户分布情况见表1。

表1 本研究中抽样框及其分布

1.2 研究设计和样本量大小

为了估计该地区新城疫群间流行率，我们于2013年5月开展了一次横断面调查。由于该地区不同乡镇养殖场的数量存在较大差异，因此我们采取了按比例进行随机抽样的策略。在确定抽样场点数时，设定置信水平为95%，预期群间流行率为10%，可接受误差为5%，采用Win Episcope2.0计算需要抽取的群体数量。对于群内抽取的样本数量，则以发现病原为调查目的，采取的是基于风险的抽样策略，优先将临床发病或者体质较弱的鸡作为抽样对象。

1.3 病例定义

采用病毒分离与鉴定方法，至少检出1个新城疫病毒强毒阳性个体的养鸡场定义为新城疫强毒感染阳性场，未检出新城疫强毒的养鸡场定义为阴性场。

1.4 样品采集和调查问卷

在养殖场采集鸡的呼吸道和泄殖腔双拭子，在抽样的同时进行问卷调查。问卷内容包括养殖情况、饲养管理情况和免疫情况等。调查问卷由培训后的当地兽医部门工作人员负责访谈和填写。

1.5 样品检测方法

采用接种10日龄SPF鸡胚进行病毒分离的方法对每个样品进行单独检测。病毒分离系检测的标准方法，其特异性和敏感性均为100%。对于分离到的新城疫病毒，则采用建立的复合RT-PCR方法进行序列测定，通过分析其裂解位点的氨基酸组成来分析其致病性，通过构建其F基因片段遗传进化树来分析其分类地位和遗传进化关系[7]。

2 结果

2.1 样本量大小计算

群体样品量计算：以测定流行率为目的，在置信水平为95%，预期群间流行率为10%，可接受误差为5%，抽样框总数为615的情况下，需要抽取的群体数量为113户，为了防止在抽样过程中出现户主外出等意外情况，计划按各乡镇养殖比例随机抽取120户，样品分布情况详见表1。

群内样本量计算：在养殖场内以发现病原为目的，优先采用基于风险的抽样策略，即优先采集发病禽的样品，群内预期流行率设定为10%，在置信水平为95%，病毒分离方法的敏感性为100%，每户鸡饲养量在300～12 000之间，故需要采集的样本量约为28～29个/群，因此每群设计的采样量确定为30个。

2.2 新城疫病毒分离与鉴定

对从120个场采集的3 600份棉拭子样品进行了病毒分离与鉴定，结果共分离到19株新城疫病毒。通过对所有分离到的新城疫病毒F基因主要功能区片段进行测序和分析，结果表明所有的毒株在F蛋白裂解位点的氨基酸组成均为112RRQKRF117，表明所有分离到的新城疫病毒均为强毒株。通过构建新城疫病毒F基因的遗传进化树，结果表明所有的分离株均属于基因VII型，不同养殖场分离到的病毒高度同源，表明其可能具有同一来源。与2006年该地区分离到的新城疫病毒相比，尽管同属于基因VII型，但新城疫病毒已发生明显变异。病毒遗传进化树见图1。

图1 新城疫病毒宁夏分离株F基因遗传进化树

2.3 新城疫群间流行率

结果显示，所分离到的19株新城疫病毒分别来源于7个不同的养殖场，故该地区新城疫群间流行率为5.83%（95% CI 1.64%～10.03%）。

2.4 养殖情况调查

该地区养殖主要以蛋鸡为主，在调查中未发现水禽混养的现象。养殖户大多具有多年的养殖经验，但生物安全管理水平普遍较低，基本没有消毒设施。在个别地区蛋鸡饲养密度极高，养殖小区内管理水平多样，因此疫病流行比较复杂。该地区另外一个典型的特点就是新城疫免疫比较频繁，尤其是活疫苗，新城疫活疫苗的使用频率基本上都在每月一次以上。在调查过程中还发现，自2012年底至2013年3月在调查的120户中有49户养殖的鸡群先后出现精神沉郁、产蛋下降、急性死亡等临床症状，目前有57户存在表现为扭颈等神经症状的感染后期的鸡，表明该地区疫病流行已经有一段时间，疫病流行形式较为复杂，短期内达到控制的难度较大。我们在研究中也发现该地区有H9亚型禽流感等其他疫病的存在和流行。

3 讨论

新城疫是长期严重危害我国养禽业的一种重要疫病。自20世纪80年代以来，我国采取了全面免疫的防控策略，特别是近年来，随着疫苗质量的持续提高，免疫工作越来越受到普遍重视，新城疫在全国的流行呈下降趋势，一方面全国报告新城疫疫情发生次数呈下逐年降趋势，另外一方面，新城疫强毒感染的带毒率也呈下降趋势。但在部分地区，新城疫仍然持续存在，已经成为一种地方流行性疫病，且表现出新的流行特点，如宿主范围扩大、免疫失败现象普遍、免疫带毒持续存在、病原流行多样化等[2]。

在《国家中长期动物疫病防治规划（2012-2020年）》中，明确提出了我国新城疫的阶段性控制目标，到2020年全国新城疫达到控制标准，一方面全国新城疫的流行率要下降到一定水平，另外一方面则不能发生区域性新城疫暴发或流行。要达到这一阶段性控制目标，除了要继续重视免疫工作之外，还要注意以下几个方面的问题：一是要继续开展基于风险的病原学监测，在养殖密集地区、候鸟栖息地周边养殖场、边境地区等开展主动监测，掌握病原分布特征、判断流行趋势、提高预警水平。二是要加大被动监测力度，对报告发生疫情的病死禽都要开展实验室检测和诊断，对波及范围大、死亡率高的疫情要进行病毒分子特征研究，开展免疫效果评估，评价当前商品化疫苗对流行毒株的免疫保护效果。三是要科学合理的使用疫苗。由于新城疫活疫苗使用方便、价格低廉，大多养殖户采用活疫苗进行密集免疫，每月免疫一次，高频率采用活疫苗带来的副作用除了可能造成免疫麻痹之外，对中和抗体也有一个中和作用，反而会降低免疫效果。建议禁止使用I系苗，研究表明I系苗的毒力较强（ICPI在1.2以上），按照OIE定义属于强毒，不宜用来免疫家禽，存在散毒风险。此外，最近国内成功研制了与主要流行基因型抗原性和基因型匹配性较好的重组新城疫病毒（A-VII株）灭活疫苗，有望降低免疫带毒和免疫失败的现象。四是要正确评价免疫的作用。现阶段对易感禽群进行新城疫免疫是必不可少的，但不能完全依赖疫苗。对于传染病控制的三个环节，即传染源、传播途径和易感动物，疫苗免疫仅仅针对的是提高易感动物抵抗力，是动物疫病控制的最后一个环节，应该在消灭传染源、切断传播途径和免疫易感动物三个方面形成合力才能起到最佳的防控效果。五是要建立科学合理的预警监测体系。由于现有的实验室检测方法不能区分疫苗免疫和野毒感染所产生的抗体，故建议在规模化养殖场可以科学设置哨兵鸡，以有效区分疫苗免疫和野毒感染（DIVA），满足早期预警的目的。

本研究表明，新城疫在该地区群间流行率为5.83%（95% CI 1.64%～10.03%），表明在该地区新城疫仍然是流行的重要动物疫病，新城疫在该地区可能已经成为地方流行性疫病，病原持续存在，在遇到免疫状况不好的鸡群时造成大规模发病和迅速扩散的风险仍然存在。通过对该地区的现场调查发现，该地区为新城疫的老疫区，环境当中新城疫野毒污染严重，新城疫已经成为一种地方流行性疫病，造成这种情况的主要原因包括：（1）局部地区家禽饲养密度过高，疫病发生和传播风险大。该地区曾先后建立了多个蛋鸡养殖小区，小区内部没有实现统一的饲养管理，生产经营方式多样，给疫病控制带来巨大风险；（2）该地区尽管散养的比例较低，但规模化程度和生物安全管理水平不高，在养殖小区存在病死禽随意丢弃、粪便未进行无害化处理随意堆放等现象，给疫病传播带来巨大风险；（3）该地区新城疫活疫苗使用过于频繁。活疫苗免疫次数过多，不但会中和免疫抗体，还有可能导致免疫麻痹。

本研究的局限性：（1）检测方法方面。由于我国对新城疫采取了普遍免疫的防控策略，在高抗体水平情况下病毒分离比核酸检测的难度要大，故病毒分离的方法测定的流行率可能比真实的流行率要低。（2）抽样框方面。本研究以该地区2013年春季集中免疫档案作为抽样框，可能少数散养的养殖户会有遗漏，尽管该地区家庭小规模散养的比例极少，但对结果仍有一定的偏倚。（3）抽样策略方面。在群内抽样时优先采集发病禽，但发病禽有可能是由其他病原体引起的，因此采用这种抽样策略可能会导致结果发生偏倚。（4）预期流行率方面。由于本研究中预期设定的群内流行率为10%，但在免疫条件下新城疫的场内流行率可能会低于这个水平，故在场内实际需要采集的样本量比不能真实地反映实际情况。（5）研究设计方面。由于横断面研究方法本身就是在一个时间节点上疫病的流行现状，对于尚在潜伏期以及感染恢复期的病原可能检测不到，最终导致假阴性的产生。（6）风险因素分析方面。在调查过程中，尽管搜集了很多关于饲养管理等相关的风险因素信息，但由于阳性病例太少，无法进行风险因素分析。在未来的类似研究中，要根据具体实际合理设置预期流行率，确保一定的阳性病例，探索可能的风险因素，为科学指导疫病防控提供参考。

致谢：

本研究在实施过程中得到了宁夏回族自治区动物疾病预防控制中心、中卫市动物疾病预防控制中心和沙坡头区动物疾病预防控制中心的大力支持，在此特别感谢！

A Cross-sectional Survey of the Prevalence of Newcastle Disease in Chicken Flocks in Ningxia

Liu Hualei1，Zheng Dongxia1，Lv Yan1，Wang Jingjing1，Zhao Yunling1，Ge Shengqiang1，Wang Xiaoliang2，Li Zhixin2，Zhang Xuejun2，Wang Fujiang3，Men Shengbao4，Wang Zhiliang1
（1. China Animal Health and Epidemiology Center，Qingdao，Shandong 266032；2. Ningxia Animal Disease Prevention and Control Center，Yinchuan，Ningxia 750002；3. Zhongwei Animal Disease Prevention and Control Center，Zhongwei，Ningxia 755000；4. Shapetou District Animal Disease Prevention and Control Center；Zhongwei，Ningxia 755000）

Newcastle disease is considered endemic in many regions of China. To determine the prevalence of Newcastle disease in Ningxia，a cross-sectional study was conducted. Chicken flocks（n=120）were randomly selected，and the disease status was ascertained by testing individual swab samples using virus isolation and sequencing. The estimated true prevalence was 5.83%（95% CI 1.64%-10.03%）. Phylogenetic analysis revealed that all isolates belonged to genotype VII. Obvious evolution were identified in Newcastle disease viruses compared with the strains responsible for the Newcastle disease outbreaks in 2006.

newcastle disease；prevalence；cross-sectional survey；genotype VII

S858.3

B

1005-944X（2015）10-0001-05

公益性行业（农业）科研专项（201303033）

王志亮

注：刘华雷、郑东霞对本文有相同的贡献

[1]王志亮，刘华雷. 新城疫[M]. 北京：中国农业出版社，2012：1-3.

[2]刘华雷，王志亮. 新城疫的流行历史与现状[J]. 中国动物检疫，2015，32（6）：1-4.

[3]Liu H，Lv Y，Afonso C L，et al. Complete genome sequences of new emerging Newcastle disease virus strains isolated from China[J]. Genome Announc. 2013，1（1）：e00129-12.

[4]Xie Z，Xie L，Chen A，et al. Complete genome sequence analysis of a Newcastle disease virus isolated from a wild egret[J]. J Virol. 2012，86（24）：13854-13855.

[5]刘华雷，王晓亮，刘国华，等. 宁夏地区新城疫分子流行病学特点分析[J]. 中国家禽，2008，30（9）：9-12.

[6]刘华雷，王晓亮，Ricardo J，等. 2012 年宁夏H5N1 亚型高致病性禽流感疫情回顾性调查[J]. 中国动物检疫，2014，31（9）：57-61.

[7]Liu H，Zhao Y，Zheng D，et al. Multiplex RT-PCR for rapid detection and differentiation of class I and class II Newcastle disease viruses[J]. J Virol Methods，2011，171（1）：149-155.

王伟涛）