麦角硫因的合成与降解代谢

刘 琦，张维亚，2，姜文侠*

1中国科学院天津工业生物技术研究所 天津市工业生物系统与过程工程重点实验室 中国科学院系统微生物工程重点实验室，天津 300308;2 天津科技大学生物工程学院，天津 300457

麦角硫因(L-Ergothioneine，EGT)是天然的2-硫代咪唑氨基酸，溶解状态下存在硫醇和硫酮两种结构的互变异构体，由于硫羰基的稳定性高于巯基［1］，故在生理pH 条件下主要以硫酮的形式存在。EGT 的标准氧化还原电势为-0.06 V，其它硫醇的电势一般在-0.2～-0.32 V 之间［2］，因此，EGT 在生理环境下比其它抗氧化剂更加稳定，不易自发氧化。图1 是EGT 几种异构体的化学结构［3］。

图1 麦角硫因的互变异构体结构Fig.1 Tautomeric structures of ergothioneine

EGT 是次生代谢产物，蕈菌是目前发现的最有潜力的生物合成制备EGT 的菌种，但关于EGT 生物合成与降解代谢的研究报导较少，至今EGT 在大型真菌中的合成代谢途径尚不清楚。由于近年来EGT 的应用与合成重新受到重视，本文主要介绍EGT 的代谢研究进展，以期指导EGT 的高强度发酵合成研究及产品的应用开发。

1 EGT 在微生物中的生物合成

1.1 麦角菌中EGT 的生物合成

最初Tanret［4］在麦角菌(Claviceps purpurea)的菌核中发现EGT。Heath 等［5］研究麦角菌中EGT 的生物合成时发现，EGT 主要分布于分生孢子而非菌核中，并且，EGT 与生物碱的生物合成过程相互独立。

Heath 和Wildy［6］在以［2-14C］醋酸盐为碳源的化学合成培养基中培养麦角菌，10 d 后收集菌体，对分离得到的EGT、组氨酸、谷氨酸及其它氨基酸进行了体外实验，结果发现:EGT 经碱处理降解为三甲胺和巯基咪唑丙烯酸，然后进一步降解巯基咪唑丙烯酸，先经钠汞齐还原，再利用H2O2氧化生成咪唑丙酸，咪唑环经苯甲酰氯裂解，依次酯化及水解，再经亚铬酸铜脱羧，最终检测到EGT 咪唑环上的脒碳、5 碳链、羧基和甲基具有放射性同位素。采用与上述相同的实验方法降解分离得到的组氨酸，生成带有放射性的脒碳、5 碳链和羧基，证明EGT 降解产物和组氨酸降解产物的放射性分布极相似，说明麦角菌中EGT 和组氨酸的生物合成途径可能一致，由此推测EGT 由组氨酸或组氨酸的结构类似物合成。在含有［2(环)-14C］组氨酸和［α-14C］组氨酸的培养基中培养麦角菌，分离得到的EGT 经检测具有放射性，证明组氨酸分子中的咪唑环完全参与了EGT 的生物合成，验证了组氨酸是合成EGT 的前体［7］。

研究同时发现分离得到的谷氨酸盐的放射性也很高，推测醋酸盐经三羧酸循环形成谷氨酸盐，但EGT 和组氨酸侧链中的碳原子放射性均较低，说明其侧链并非来自谷氨酸盐。进一步实验发现，［2(环)-14C］组胺不能将咪唑环提供给EGT 和组氨酸，表明组胺不是合成EGT 的前体。利用相同的方法验证了一些含组胺或带侧链的咪唑衍生物也并非合成EGT 的前体［8］。

Heath 等［8］利用含有［35S］蛋氨酸的培养基培养麦角菌，分离得到具有放射性的EGT，证明蛋氨酸参与了EGT 的生物合成。

综上得知组氨酸和蛋氨酸是麦角菌中合成EGT 的前体，谷氨酸盐、组胺及一些含组胺或带侧链的咪唑衍生物并未参与EGT 的生物合成。

1.2 粗糙链孢霉中EGT 的生物合成

Melville 等［9，10］发现粗糙链孢霉(Neurospuru Crussa)能够合成EGT，并利用同位素示踪法研究了EGT 生物合成的前体及其生物合成途径。

1.2.1 EGT 分子中咪唑环的来源

Melville［10］将粗糙链孢霉置于含有［2-14C］组氨酸的培养基中培养24 h，利用氧化铝柱层析分离［11］，对流出组分进行放射性检测［12］，结果表明:具有放射性的峰与EGT 的出峰时间及峰形均一致，碱处理此组分后生成带有微量放射性的三甲胺和具有明显放射性的巯基咪唑丙烯酸，证明了流出组分是EGT，组氨酸是合成EGT 的前体［9］。

此外，发现如果培养基中含有高浓度的［14C］组氨酸，则巯基咪唑丙烯酸与组氨酸的比放射性一致，说明内源组氨酸合成EGT 的途径完全被外源的［14C］组氨酸所抑制。同时，在组氨酸合成EGT 的过程中，咪唑环被完整地保留下来，这是因为如果咪唑环在C-2 原子处发生裂解，则必将丢失部分被标记的碳原子。

1.2.2 EGT 分子中侧链的来源

Melville 推测EGT 合成可能的中间体还包括咪唑丙烯酸、咪唑丙酮酸及其含硫衍生物，它们可能取代了组氨酸分子中的α-氨基氮原子。为验证此推测，Melville［13］将含有15N 标记的组氨酸(［15N］组氨酸的来源:将粗糙链孢霉置于以［15N］铵盐为唯一氮源的培养基中，培养结束后，酸解菌体蛋白分离得到［15N］组氨酸)作为前体培养粗糙链孢霉，分离得到的EGT 被降解成巯基咪唑丙烯酸和三甲胺，通过分析组氨酸、EGT 及其降解产物，发现15N 在巯基咪唑丙烯酸分子中的咪唑环和三甲胺分子中的α-氮原子间的分布高度一致，证明整个组氨酸分子，包括侧链中的氮原子均参与了EGT 的生物合成［9］。

1.2.3 EGT 分子中甲基的来源

将粗糙链孢霉置于含有［14C］蛋氨酸的培养基中培养，合成的EGT 具有高度放射性，降解得到的甲基也具有放射性［10］。利用［14C］甲酸盐和［14C］甲醛作为前体，合成的EGT 并非在甲基处产生放射性，而是部分巯基咪唑丙烯酸带有了放射性，说明EGT 分子中的甲基可能通过转甲基作用合成，要验证此推测，需要含放射性氢原子标记的甲基供体作实验材料。

Melville 等［13］利用同时含有14C 和氘(D)标记的蛋氨酸进行实验，含有双标记的蛋氨酸合成EGT后被降解成三甲胺，比较含有14C 的三甲胺与［14C］蛋氨酸，发现两者均含有大量的氘。由于蛋氨酸甲基中氢和碳原子的个数比为3∶1，甲酸盐分子中氢和碳原子的比为1∶1，甲醛分子中的氢和碳原子之比为2∶1。将蛋氨酸甲基中D∶14C 的比值设为1，假设蛋氨酸中的甲基碳原子经甲酸盐或甲醛介导转移至EGT:如果是通过甲酸盐介导，则EGT 甲基中D∶14C 的比值不会超过1/3，若是经甲醛介导，比值则不会超过2/3，而实验结果显示D∶14C 的比值超过了2/3，说明蛋氨酸至少转移了一个完整的甲基至EGT。由于实验对放射性同位素进行了高度稀释，未得到其它两个甲基的确切来源。

为验证EGT 分子中三个甲基的来源，将蛋氨酸缺陷型突变株置于含有双标记蛋氨酸的培养基中培养，合成的EGT 经降解得到的三甲胺含有大量的14C 和氘，同时，三甲胺分子中D∶14C 的比值与蛋氨酸分子中D∶14C 的比值基本一致。如上所述，若EGT分子中的甲基来自于蛋氨酸经由甲酸盐或甲醛介导生成，则降解得到的三甲胺分子中D∶14C 的比值会小于蛋氨酸分子中D∶14C 的比值，而实验结果发现三甲胺和蛋氨酸分子中的D∶14C 比值基本一致，由此说明了EGT 分子中的三个甲基均经蛋氨酸转甲基作用合成。

1.2.4 EGT 分子中硫原子的来源

Melville 等［10］在含有放射性标记的硫酸盐培养基中添加大量不具放射性的含硫化合物，如胱氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、硫代硫酸盐、胆碱硫酸盐、硫代乙酰胺和硫氰酸盐，进行了巯基供给的竞争性验证实验。结果表明硫代硫酸盐和含硫氨基酸是合成EGT 有效的巯基供体，其中胱氨酸优于蛋氨酸，半胱氨酸则是最佳的巯基供体，硫代硫酸盐要首先转化为半胱氨酸，再参与EGT 的合成。这个反应也在构巢曲霉(Asp.nidulans)中得到了验证［14］。

1.2.5 EGT 分子的生物合成顺序

Melville［9］推测EGT 的生物合成顺序有两种:(1)组氨酸经半胱氨酸巯基化合成巯基组氨酸(thiolhistidine)，再经蛋氨酸转甲基作用生成EGT;(2)组氨酸经蛋氨酸转甲基作用生成组氨酸甜菜碱(hercynine)，再经半胱氨酸巯基化合成EGT。

为此，将粗糙链孢霉置于含有［2-14C］巯基组氨酸的培养基中培养，合成的EGT 具有极微量的放射性［10］。由于菌体的抽提物具有大量的放射性，表明巯基组氨酸能够穿透细胞膜，由此证明了巯基组氨酸不是合成EGT 的中间体。

Melville［9］将粗糙链孢霉分别置于添加了外源［2-14C］组氨酸，以及［2-14C］组氨酸和组氨酸甜菜碱组合物的培养基中培养，研究产物中EGT 的含量及总放射性的变化。经氧化铝柱层析分离，［2-14C］组氨酸实验组出现了两个放射性峰，第二个峰的峰面积大于第一个峰，EGT 的出峰时间与第二个峰一致。添加［2-14C］组氨酸与组氨酸甜菜碱组合物的实验组中，同样出现两个放射性峰，但第一个峰的峰面积远大于第二个峰，EGT 的出峰时间仍与第二个峰一致，其中第二个峰的峰面积与［2-14C］组氨酸实验组中第二个峰的峰面积相近。实验证明了EGT的保留时间长于［2-14C］组氨酸的保留时间，同时外源添加的组氨酸甜菜碱几乎完全抑制了内源组氨酸合成EGT 的过程，说明组氨酸甜菜碱是EGT 合成的直接中间体，即EGT 的生物合成顺序为组氨酸先经蛋氨酸转甲基作用生成组氨酸甜菜碱，再与半胱氨酸发生巯基化合成EGT。

当硫源缺乏时，粗糙链孢霉细胞内仅含有组氨酸甜菜碱，硫源充足时，细胞内迅速合成EGT，同时组氨酸甜菜碱的含量不断下降，亦证明了组氨酸甜菜碱是合成EGT 的中间体。

1.2.6 催化EGT 合成的酶的推测

Ishikawa 等［15，16］使用粗糙链孢霉的无细胞抽提液证明了EGT 由组氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸合成，其中组氨酸甜菜碱和组氨酸甜菜碱-半胱氨酸硫氧化物(hercynylcysteine sulfoxide)是合成EGT 的中间体，推测S-腺苷蛋氨酸依赖性甲基转移酶［S-adenosyl methionine (SAM)-dependent methyltransferases］，Fe2+依赖性氧化酶［iron(II)-dependent oxidase］和5-磷酸吡哆醛依赖性β-裂合酶［pyridoxal 5-phosphate (PLP)-dependent-lyase］很可能在EGT 的合成途径中起到了催化的作用，但并未对这几种酶进行研究与验证。

1.3 分枝杆菌中EGT 的生物合成

1.3.1 分枝杆菌科中EGT 生物合成的前体

Genghof 等［17］研究了100 余种分枝杆菌科(Mycobacteriaceae)中EGT 及组氨酸甜菜碱的生物合成过程，结果同Melville 的研究结果一致。在分别添加［35S］硫酸盐和［2-14C］组氨酸的培养基中培养分枝杆菌，分离得到EGT 和组氨酸甜菜碱，由于EGT和组氨酸甜菜碱的保留时间差异很小，采用两根氧化铝层析柱串联分离两种物质，并单独分析每根色谱柱的流出组分，得到组分的放射性和甜菜碱峰随时间的变化曲线。由于甜菜碱是EGT 和组氨酸甜菜碱分子中的特殊基团，对甜菜碱的检测可以间接反映EGT 和组氨酸甜菜碱的动态变化过程。

［35S］硫酸盐实验组样品经第一根色谱柱分离，出现一个具有放射性的甜菜碱峰，再经第二根色谱柱分离，出现两个甜菜碱峰，但只有第二个色谱峰具有放射性，说明第一个色谱峰是组氨酸甜菜碱，第二个色谱峰是EGT，EGT 保留时间长于组氨酸甜菜碱的保留时间，放射性来源于［35S］硫酸盐。

［2-14C］组氨酸实验组样品经第一根色谱柱分离后，同样出现一个具有放射性的甜菜碱峰，再经第二根色谱柱分离，出现具有两个放射性的甜菜碱峰，表明［2-14C］组氨酸参与了组氨酸甜菜碱和EGT 的生物合成过程，上述两个色谱峰分别为组氨酸甜菜碱和EGT。

实验证明了EGT 和组氨酸甜菜碱在分枝杆菌中的合成路径一致，组氨酸分子中的咪唑环完整地参与了EGT 和组氨酸甜菜碱的生物合成，组氨酸甜菜碱再经巯基化合成EGT。因此，组氨酸甜菜碱是分枝杆菌(Mycobacteria)合成EGT 的直接前体。

1.3.2 分枝杆菌EGT 生物合成途径中关键酶的推测

Ishikawa［15，16］推测SAM依赖性甲基转移酶、Fe2+依赖性氧化酶和PLP 依赖性β-裂合酶可能对EGT 的生物合成起到了催化作用。为探寻控制EGT 合成的相关基因，Seebeck［18］利用上述几种酶进行体外催化实验，模拟分枝杆菌中EGT 的生物合成途径。由于Fe2+依赖性酶［iron(II)-dependent enzymes］难以从序列中被单独识别，同时PLP 结合蛋白(PLP-binding proteins)的功能尚不明确［19］，研究人员首先从甲基转移酶(methyltransferases)入手分析。编码分枝杆菌甲基转移酶的一组基因紧邻PLP 结合蛋白，形成含有5 个基因的基因簇，推测这个基因簇很可能与EGT 的合成相关，Seebeck 将这5个基因命名为egtA、egtB、egtC、egtD 和egtE，并进行了实验验证，图2 是对分枝杆菌EGT 生物合成途径的推测［18］。

图2 分枝杆菌中麦角硫因生物合成途径的推测Fig.2 Possible biosynthetic pathway of mycobacterial ergothioneine

为验证EgtD 是否为组氨酸甲基转移酶，从包皮垢分支杆菌(Mycobacterium smegmatis)中克隆出其相关基因，并在E.coli 中重组表达。纯化后，采用蛋白原氨基酸(proteinogenic amino acids)作为底物分析了EgtD 的甲基化活性，同时利用SAM 和S-腺苷高半胱氨酸核苷酶(S-adenosylhomocysteine nucleosidase)进行了对比分析。反应过程中，产物2-组氨酸甜菜碱是电喷雾质谱唯一检测到的甲基化产物，并利用酶与紫外偶联检测技术验证了组氨酸和α-N，N-二甲基组氨酸(R-N，N-dimethylhistidine)是EgtD的最适底物［20］。

此外，对egtA、egtB、egtC 和egtE 四个基因编码的产物进行了验证。EgtA、EgtC 和EgtE 的序列分别类似于γ-谷氨酰半胱氨酸裂合酶(γ-glutamyl cysteine ligase)、Ⅱ型谷氨酰胺转氨酶(class-II glutamine amidotransamidase)和PLP 结合蛋白［21］，EgtB具有与甲酰甘氨酸合成酶(formylglycine-generating enzymes，FGEs)相同的DUF323 结构域［22］，并且EgtB 和EgtC 的真菌同系物作为融合蛋白被编码，表明这两个蛋白形成了一个功能单元。

为验证EgtB 是否具有硫氧化酶的活性，利用γ-谷氨酰半胱氨酸(γ-glutamylcysteine)作为巯基供体与产物2 进行反应，HPLC 分析显示250 nm 处产物的分子量与产物3 相同，其结构经1H、COSY 和HSQC NMR 光谱得到验证，证明了EgtB 具有硫氧化酶的活性。同时发现只有Fe2+存在时EgtB 才表现出活性［15］。进一步研究发现产物2 是优先的巯基受体，组氨酸与EgtB 的亲和力则较弱［15，16］。为推测产物2 能否直接与半胱氨酸反应生成产物4，利用半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine)和谷胱甘肽替代γ-谷氨酰半胱氨酸与EgtB 进行反应，结果均未生成产物4，证明产物3 是分枝杆菌EGT生物合成途径的重要中间体。

对于产物3 发生谷氨酰胺键的水解以及由产物4 生成EGT 的反应，推测分别由EgtC 和EgtE 催化。实际上，由重组EgtB 和EgtC 催化产物2 形成产物4的过程，即证明EgtC 具有谷氨酰氨基转移酶(glutamine amidotransferase)的活性。由于重组EgtE 失败，实验由β-裂合酶替代EgtE 催化产物4 与丙酮酸盐反应生成了EGT［18］。

Seebeck 研究推测了EgtA、EgtB、EgtC、EgtD 和EgtE 在EGT 生物合成途径中所起到的作用，其中最重要的两个反应是由组氨酸特异性甲基转移酶(histidine-specific methyltransferase)EgtD 催化组氨酸发生的甲基化反应，以及由Fe2+依赖性酶EgtB催化产物2 发生的氧化硫化反应。不同微生物中含有这组酶暗示了EGT 是放线菌目、蓝细菌、盘菌亚门、担子菌门、拟杆菌门和α-、β-、γ-、δ-变形菌门的共同产物。由于高等真核生物缺乏这簇基因，Seebeck 认为阐明EGT 的生物合成途径有可能为抗菌治疗提供一个新的靶点［18］。

1.4 其它微生物中EGT 的生物合成

Genghof［23］研究了包括链霉菌在内的一些真菌及放线菌中EGT 与组氨酸甜菜碱的生物合成，所考察的菌株均能合成EGT，而且除黑曲霉之外均能合成组氨酸甜菜碱。EGT 的含量在1.7～46.6 mg/100 g DW 之间，多数菌株中组氨酸甜菜碱的含量低于EGT 的含量，少数菌株中组氨酸甜菜碱的含量较EGT 高。在外源硫原子耗尽时，组氨酸甜菜碱的含量升高，EGT 的含量随之下降，由此推测组氨酸甜菜碱是合成EGT 的前体。

2 麦角硫因的降解代谢

2.1 微生物中EGT 的降解代谢

本文1.2 叙述了组氨酸甜菜碱是EGT 生物合成的直接前体，但它是否为EGT 的降解产物?Neufeld 等［24］研究发现EGT 分子中的硫原子可被来自稻瘟病菌(Piricularia oryzae)和云芝(Polyporus versicolor)中的硫氧化酶氧化，氧化产物并不知晓，但如果这个氧化反应与EGT 的化学反应类似，则产物应该是组氨酸甜菜碱。Yanasugondha 等［25］研究了粪产碱菌(Alcaligenes faecalis)中EGT 的降解代谢，EGT 被降解成三甲胺和巯基咪唑丙烯酸。

2.2 EGT 在哺乳动物体内的代谢与分布

药物代谢动力学分析表明，向老鼠静脉注射EGT 后，EGT 迅速地由血液流向组织，主要流入肝脏和肾脏，即使肝、肾被切除也不会改变流向［9］。Wolf 等［26］将含有α-14C 的EGT 注入老鼠体内，研究其代谢产物及分布，结果表明6 h 内EGT 发生分解，仅有0.14%的EGT 生成CO2，而相同条件下注入等量的［α-14C］组氨酸，发现4 h 内即会有12% 的［α-14C］组氨酸生成CO2。此外，约6 h 后肝脏中2%～6%的EGT 转化为合成蛋白质所需的氨基酸，而肝脏中非蛋白成分的放射能则非常高，约为EGT注射剂量的17%～31%，因此肝脏是EGT 代谢的主要场所，EGT 在代谢过程中首先聚集于肝脏，随后降解成组氨酸甜菜碱，再进一步发生分解。由此推测EGT 的主要代谢反应是首先脱去巯基，Heath［27］证实了此推测，他在研究含35S 的EGT 在老鼠体内的降解过程中发现，尿液中35%的35S 以硫酸盐的形式存在。

经受长期禁食的老鼠，其组织中仍含有EGT，Kawano 等［28］证实了EGT 在老鼠体内的半衰期大概为一个月。Potter 等［29］对老鼠进行了限制EGT 供给量的实验，证实老鼠的尿液和粪便中均不含EGT，并且每天还会进行适量地吸收与积累。一只225 g 的老鼠每天可积累20 μg EGT，相对仅消耗2 μg，累积率达90%。据此计算，对于一个150 英镑的成年人，每天积累约6 mg 的EGT。Paul 等［30］证实了关于EGT 的低代谢率和高积累率部分是由肾脏对EGT 的强吸收所造成。

Heath［27］研究了老鼠、兔子、狗和猫体内的EGT代谢分布，发现EGT 主要分布于肝脏、红细胞和肾脏等组织。表1 是EGT 在四种动物组织中的分布［9］。

表1 麦角硫因在几种动物组织中的分布Table 1 Concentrations of ergothioneine in different animal tissues

数据显示，EGT 在不同的动物或同一动物的不同组织中分布显著不同，说明组织的功能与对EGT的需求相关。

3 结语

综上所述，组氨酸是麦角菌、粗糙链孢霉和分支杆菌等微生物中合成EGT 的前体。在粗糙链孢霉和分支杆菌中，组氨酸先经甲基化作用生成组氨酸甜菜碱，再由组氨酸甜菜碱合成EGT，其中在EGT的合成过程中甲基转移酶和Fe2+依赖性氧化酶起到了重要的催化作用。蛋氨酸参与了麦角菌和粗糙链孢霉中EGT 的生物合成。半胱氨酸等含硫氨基酸和硫代硫酸盐等含硫化化合物作为巯基供体参与了粗糙链孢霉中EGT 的合成。在粪产碱菌中EGT降解生成三甲胺和巯基咪唑丙烯酸。在哺乳动物体内，EGT 首先脱去巯基生成组氨酸甜菜碱，再进一步降解。

鉴于EGT 独特的生理活性和应用价值，EGT 具有广阔的市场前景，随着研究的深入，可能开发EGT 在一些特殊领域中的应用。由于食用蕈菌菌丝体中EGT 的含量较高，利用新型工业发酵技术易实现大规模可控生产，是EGT 商业化绿色生产的主导方向。蕈菌中EGT 生物合成途径的研究，将为EGT 的代谢调控及高强度生物合成研究提供理论依据。

本文作者利用食用蕈菌菌丝体液体发酵制备EGT，通过添加外源氨基酸等营养因子大幅度地提高了EGT 的代谢积累量，摇瓶发酵水平超过190 mg/L。相信随着生产成本的下降，EGT 必将适应更广阔的应用需求。

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