槲皮素铋的合成及其生物活性研究

翟广玉，渠文涛，马海英，韩 冰，樊卫华*

1郑州大学护理学院;2 郑州大学药学院，郑州 450052

铋是人和生物体非必需的微量元素。铋及其化合物在医药上广泛应用，临床上主要治疗各种微生物感染，包括梅毒、腹泻、胃炎和结肠炎等［1］。现在人们又发现铋及其化合物可以抑制癌细胞生长，具有抗癌活性，起辅助抗癌的作用［2］。

槲皮素(quercetin，图1)属于黄酮类，含有酚类结构的天然化合物，广泛存在于水果(苹果、草莓)、蔬菜(洋葱、蕃茄)、饮料(茶叶、咖啡、红酒)中［3］，它显示出多方面的生物活性，是天然的抗氧化剂，特别是具有清除体内自由基的性能，保护细胞氧化造成的损伤，能够调整细胞内信号，促进细胞的存活［5］，还具有抗炎［4］、抗病毒［5］、降血压［6］、预防心脑血管疾病［7］、防癌抗癌作用［8］。

槲皮素对金属离子具有强烈的螯合作用，可生成稳定的环状配合物。研究发现，槲皮素与不同金属离子形成配合物，其生物活性得到了不同程度的改善。Ferrer EG 等［9］合成了槲皮素钒配合物，研究发现槲皮素钒可以刺激I 型骨生长，对磷酸酯酶有抑制作用，可促进骨细胞的分裂、增殖，具有抗骨癌的作用。Zhou J 等［10］合成了槲皮素铜，研究表明槲皮素铜能够插入DNA 的碱基对中，从而影响DNA分子的构型，抑制了DNA 分子的进一步复制与转录，最终达到抗癌效果。Tabassum S 等［11］合成了槲皮素-CuⅡ-SnⅣ2配合物，可改变DNA 单链和双螺旋结构的空间结构，可以激活SOD 酶活性，清除活性氧，具有显著的抗癌活性。近年来，对槲皮素金属配合物的研究逐年增多，这对槲皮素的开发利用及寻找新药开辟了新的途径［12］。这提示经常食用一些含有槲皮素的黄酮类的食物，如苹果、洋葱、茶叶、银杏、荞麦等，可清除体内的自由基，使机体免受自由基的损伤，对降低人体内重金属离子的含量起着重要的作用。本文介绍了合成槲皮素铋的方法，并对其结构进行了表征，研究了清除自由基的能力。

图1 槲皮素的结构Fig.1 Chemical structure of quercetin

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

槲皮素(自制)，氯化铋(分析纯)，其他试剂均为分析纯。

FTS-3000 型红外光谱仪(KBr 压片);德国耐驰(Netzsch)STA 409 PC/PG 差热分析仪;UV-240 型紫外-可见分光光度计(日本岛津公司);400 MHz 核磁共振仪(Bruker);RE-52AA 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)。

1.2 槲皮素铋的制备

将文献［13］方法适当改进，在三颈烧瓶中，取1 mmol(302 mg)槲皮素，加入25 mL 甲醇，搅拌使完全溶解，加入甲醇钠调pH=8.5。加入预先溶于25 mL 甲醇中的1 mmol(315.34 mg)无水氯化铋溶液。在可加热的磁力搅拌器上加热回流6 h。用硅胶G板监控反应进程，待反应完成时停止回流。过滤，滤液在旋转蒸发仪上蒸干，得棕黄色固体，用甲醇冲洗三次，真空干燥器中干燥，得深棕黄色固体。

槲皮素铋为深棕黄色粉末，溶于甲醇、乙醇、DMSO，微溶于丙酮，乙酸乙酯，不溶于苯和甲苯。

1.3 清除自由基实验

溶液的配制:1 ×10-4mol/L 的DPPH 溶液的配制:精密称取10 mg DPPH，置于250 mL 容量瓶中，加入少量无水乙醇，待溶解后再用无水乙醇定容至刻度，混匀，避光，置于冰箱保存。供试液的配制:精密取各样品适量，以乙醇为溶剂，分别配制100、80、60、40、20 mg/L 的待测溶液。精确吸取不同浓度的样品溶液1 mL，分别与3 mL 1 ×10-4mol/L 的DPPH溶液混合，避光放置30 min，在517 nm 处测吸光度Ay。以相应溶剂代替样品作为空白对照，吸光度为As，相应样品溶液的吸光度为A0。DPPH 自由基清除活性按下式计算:

式中，Ay为1 mL 样品溶液与3 mL DPPH 溶液混匀后的吸光度值;As为1 mL 乙醇溶液与3 mL DPPH 溶液混匀后的吸光度值;A0为1 mL 样品溶液与3 mL 乙醇溶液混匀后的吸光度值;参考文献［13］计算自由基半数清除率。

2 结果与讨论

2.1 紫外光谱分析

槲皮素在258 nm 和360 nm 有两个吸收峰，分别属于n→π* (A 环)电子跃迁和π→π* (B 环)电子跃迁，分别对应两个生色团组成:258 nm 吸收带由苯甲酰生色团产生，为带Ⅱ;360 nm 吸收带由肉桂酰生色团产生，为带Ⅰ。

图2 槲皮素的结构及其紫外光谱特征Fig.2 Structure and UV-Visible absorption characteristics of quercetin

槲皮素铋的UV 吸收带Ⅱ由258 nm 红移至265 nm，红移7 nm;带Ⅰ由360 nm 红移至465 nm，红移95 nm(图2、3)。这是由于形成配合物后，共轭体系增大，能量降低，最大吸收向长波方向移动引起的。带Ⅰ红移远远大于带Ⅱ，这说明Bi3+是在带Ⅰ区域内与槲皮素配位形成配合物的。

图3 槲皮素和槲皮素铋的紫外光谱重叠图Fig.3 UV-Visble spectra of quercetin and quercetin-Bi complexes

2.2 红外光谱分析

槲皮素分子主要官能团红外吸收归属:υC=O1663.10 cm-1;苯环骨架振动频率υC=C1610.89 cm-1，1449.49 cm-1;δC3-OH1382.03 cm-1;υC-O酚1319.41 cm-1;υ-OH3408.74 cm-1。

槲皮素铋的红外光谱显示，羰基吸收峰υC=O1663.10 cm-1，红移至1648.48 cm-1，这是因为羰基形成了配合物引起的。槲皮素的特征吸收峰υ-OH3408.74 cm-1吸收，在槲皮素铋中是3420.34 cm-1几乎没有发生变化，这说明槲皮素的基本骨架没有发生变化。

图4 槲皮素(A)和槲皮素铋(B)的红外光谱Fig.4 IR spectrum of quercetin (A)and quercetin-Bi complexes (B)

槲皮素和槲皮素铋的红外图谱特征吸收峰比较结果显示:①槲皮素的υC=O1663.10 cm-1羰基振动频率移至1648.48 cm-1，向红移了14.62 cm-1，可见槲皮素的4-羰基参与了槲皮素铋配合物的形成［13］。②槲皮素铋配合物在613.52 cm-1出现了υM-O，说明有金属配位键生成。③苯环骨架振动频率υC=C1610.89 cm-1，和υC-O-C1262.46cm-1，分别移至1597.45 cm-1和1269.60 cm-1，说明在形成配合物后，苯环骨架的存在，只是向红移动了约几个—几十个波数［13］。

2.3 槲皮素铋的氢谱

1H NMR 谱是鉴定黄酮化合物的结构类型、确定取代基的位置和进行结构研究的有效方法。氢谱可以提供有关分子中不同种类氢原子的情况，如根据化学位移和偶合常数可以判断有关氢原子的化学环境，每种不同环境下氢原子的数目以及每个氢原子相邻的基团的结构等。槲皮素和槲皮素铋1HNMR 谱中每个氢原子的归属(400 MHz;DMSO-d6ppm)见表1。

表1 槲皮素和槲皮素铋1H-NMR 谱Table 1 1H-NMR data for quercetin and quercetin-Bi complexes (ppm)

由上述氢谱数据可知，槲皮素铋中的3＇-OH 上的氢消失，而其它4 个羟基(7-OH，5-OH，3-OH，4＇-OH)上的氢依然存在，这说明槲皮素的3＇位羟基与铋离子结合。这与紫外光谱和红外光谱数据是一致的［14］。

2.4 热差分析

加热可引起物质的物理、化学变化，同时伴随放热和吸热的产生，以及质量的变化。通过热重分析，可以了解配合物的稳定性，及其结构特征。在静态空气气氛，升温速度为10 ℃/min，差热量程为100 μV，测定温度范围从室温到784 ℃。

对槲皮素铋的热分析显示出裂解分解过程［15］。配合物的DSC 曲线上呈现出吸热和放热峰与热重分析一致。

图5 示差热重分析图Fig.5 Thermogravimetric analysis of quercetin-Bi complexes

在151 ℃附近的放热峰对应于槲皮素铋的第一步分解，主要是失去结晶水，4 个H2O，对应质量损失为13.37%。在397 ℃附近的放热峰对应于残余有机物的氧化分解，对应质量损失为48.14%。在749 ℃附近，失去CHO，对应质量损失为4.90%。最后剩余的残渣是三氧化二铋。

表1 槲皮素铋分解与失重的最大温度Table 1 The Tmax(℃)and weight loss values of the decomposition stages for the quercetin-Bi complexes

由上述槲皮素铋的热分解实验，根据残渣的重量，可以计算出氧化铋中铋的含量(实验值):

槲皮素铋中铋的含量(理论值):

由上述计算结果可以看出，实验值与理论值误差很小。结合紫外光谱、红外光谱、氢谱和热分析图谱可以写出槲皮素铋配合物的结构为:

图6 槲皮素铋的结构Fig.6 Chemical structure of quercetin-Bi complexes

2.5 槲皮素铋清除DPPH 自由基的作用

DPPH 在有机溶剂中是一种稳定的自由基，其乙醇溶液在517 nm 处有最大吸收，当有自由基清除剂存在时，由于DPPH 自由基的单电子被配对，从而使得在517 nm 处的吸光度减小，因此该法常被用来评价样品的抗氧化能力［12］。

图7 槲皮素和槲皮素铋对DPPH 自由基的清除作用Fig.7 The scavenging effect of quercetin and quercetin-Bi complexes on on DPPH free radical

从图7 可见，槲皮素和槲皮素铋都随着浓度的增大，对DPPH 自由基的清除率也增大，但是很明显槲皮素与铋离子形成配合物后，其对DPPH 自由基的清除能力略有降低。根据实验结果，槲皮素铋与槲皮素的EC50分别是8.17 mg/L 和14.07 mg/L，进一步说明槲皮素在与铋配位后，其清除DPPH 自由基能力降低，这可能是形成配合物后，邻二酚结构的羟基与铋离子配位，使其接受质子的能力降低引起的。

3 结论

槲皮素与氯化铋在碱性条件下，可生成槲皮素铋配合物。通过紫外、红外、核磁、热分析等手段对槲皮素铋进行了结构表征。光谱数据阐明了配位的位点:槲皮素的3＇位羟基与铋离子结合。通过DPPH 法测定了槲皮素铋清除自由基的能力，通过实验显示，槲皮素铋清除DPPH 自由基的能力弱于槲皮素。

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