EGCG 对衰老小鼠脑组织NF-κB 蛋白表达的影响

王晓博 ，杜 阳，谢耀光，高明川，李海兰，王 波，姜 涛*

1大连医科大学生物技术系;2 大连医科大学病理学教研室，大连 116044

表没食子儿茶素没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)是绿茶中的主要成分，是茶多酚中含量最多的单体物质。EGCG 是特定的黄烷醇类化合物，具有较强的抗氧化活性。细胞内超氧化物(，H2O2等)在代谢过程中堆积过多，不能及时清除是细胞衰老机制之一［1-3］。EGCG 是否可以通过它的抗氧化活性来抑制机体衰老过程，这是本研究需要探讨的问题。另外，细胞衰老与体内衰老相关的基因表达调控相关，其中包括炎症相关的转录因子NF-κB (nuclear factor kappaB，NF-κB)［4，5］。NF-κB 是一种具有转录激活功能的蛋白质，其与细胞凋亡的关系密切［6，7］，但最近研究发现NF-κB 的激活与细胞衰老也密切相关。2013 年，发表在Nature 上的一篇文章表明:随着小鼠的衰老，下丘脑区域的NF-κB 逐渐被激活，证实了衰老与NF-κB 信号途径的相关性［8］。本研究拟通过分析EGCG 的抗衰老作用以及对衰老小鼠脑组织NF-κB 及相关分子的表达的影响，确定EGCG 与炎症相关信号通路之间的关系，为进一步研究EGCG 复杂的生物学效应提供线索。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

3～4 月龄清洁级雄性昆明小鼠20 只，体重50±10 g，由大连医科大学SPF 实验动物中心提供。随机分为2 组，模型组和对照组。其中模型组15只，按照50 mg/(kg·d)颈背部皮下注射5%D-半乳糖生理盐水溶液，对照组5 只小鼠，按照1 mL/(kg·d)颈背部皮下注射生理盐水溶液，连续注射9 w。建模成功后，将模型组小鼠随机分为二组，衰老组和EGCG 处理组。衰老组5 只，按照1 mL/(kg·d)颈背部皮下注射生理盐水;EGCG 处理组10 只，以1 mg/(kg·d)皮下注射EGCG 生理盐水溶液，连续注射5 w;另领取3～4 月龄清洁级雄性昆明小鼠5 只设为年轻组。因此，最后利用年轻组小鼠5 只、衰老组小鼠5 只以及EGCG 处理组小鼠10 只进行研究。

1.2 主要试剂

EGCG(纯度99.5%)购自浙江乾盛康药业有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)活性检测试剂盒(批号:20101109)系南京建成生物工程研究所产品;β-半乳糖苷酶活性检测试剂盒为碧云天生物试剂公司产品，抗鼠β-actin 抗体，抗鼠NF-κB-P65，抗鼠IκBα(Y42)抗体以及辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG 购自巴傲德生物科技公司。

1.3 行为学实验

模型组小鼠和对照组小鼠每10 d 进行体重监测;并在第9 w 对小鼠进行记忆能力训练和检测。在设定的迷宫中对两组小鼠进行为期5 d，每天10次的训练，记录50 次中的正确次数。记忆能力测试主要根据逃避到安全区的时间赋分，直接逃避到安全区给予2 分，受击后再进行逃避给予1 分，否则为0 分，以总分作为记忆成绩［9］。

1.4 小鼠外周血SOD 活性检测

采用断尾取血的方法收集各组小鼠外周血，3500 rpm 离心10 min，收集血清。利用SOD 活性检测试剂盒，在酶标仪的589 nm 波长下检测后进行数据处理。

1.5 小鼠海马区神经元的SA-β-Gal 活性分析

当EGCG 处理模型组小鼠4 w 时，利用10%水合氯醛腹腔注射分别麻醉年轻组、衰老组以及EGCG 处理组小鼠各1 只，断头取出脑组织后立即投入4%多聚甲醛固定液中固定24 h，进行冰冻切片，利用SA-β-Gal 染色试剂盒对病理切片进行洗脱、固定、染色、脱色、封片处理，最后在高倍显微镜下观察海马区神经元染色比率。

1.6 小鼠脑组织NF-κB 和IκBα 蛋白表达变化分析

EGCG 处理模型组小鼠5 w 后，分别取年轻组(n=4)、衰老组(n=4)以及EGCG 处理组(n=8)小鼠脑组织50 mg 于液氮研磨后置于EP 管中，加入蛋白裂解液200 μL 于4 ℃裂解30 min，同时每10 min 震荡一次，每次30 s，4 ℃，12000 rpm 离心10 min，取上清，考马斯亮蓝G250 对蛋白进行定量后进行Western blotting 分析，以β-actin 为内参照检测NF-κB-P65 和IκBα(Y42)蛋白表达变化情况。

2 实验结果

2.1 模型组小鼠的行为学变化及外周血SOD 活性测定

研究结果表明，与对照组相比，模型组小鼠30 d后体重增长缓慢(表1，图1)，且毛发较年轻组黄，进食量减少。与对照组相比，模型组小鼠正确逃避反应能力迟缓，正确次数明显减少，记忆评分较低，均具有显著性差异;模型组小鼠外周血中，SOD 活性也显著性降低(表2)。

表1 D-半乳糖诱导小鼠衰老过程中的体重变化Table 1 The changes of weight for the mice treated by d-gal compared to control mice

图1 D-半乳糖诱导小鼠衰老过程中的体重变化趋势图Fig.1 The tendency of weight changes of mice during d-gal treatment

2.2 EGCG 的抗衰老作用研究

当EGCG 处理衰老模型小鼠4 w 时，进行小鼠外周血SOD 活性检测和小鼠大脑病理切片SA-β-Gal 染色分析。结果发现:与衰老组相比，EGCG 处理组SOD 活性明显升高，达到115.24 ±11.06(图2)。小鼠大脑病理切片进行SA-β-Gal 染色分析检测发现:衰老组小鼠海马区细胞在一个视野下有20%～30%细胞膜被蓝染，而年轻组小鼠海马区细胞只有5%左右被蓝染，EGCG 处理组，在多个视野下，只能观察有5%细胞膜周围被蓝染现象，与年轻组小鼠海马区染色结果相似(图3)。因此，EGCG处理后海马区衰老细胞明显减少。

表2 模型组与对照组小鼠的记忆力及外周血SOD 活性比较Table 2 Comparison of memory capability and SOD activity in mice serum between model group and control group

2.3 EGCG 对小鼠脑组织中NF-κB 信号途径相关蛋白表达的影响

图2 年轻组、衰老组及EGCG 组小鼠外周血SOD 活性分析Fig.2 The changes of SOD activity for young group，aging group and EGCG treatment group

图3 小鼠海马区神经元病理切片的SA-β-Gal 染色分析(×400)Fig.3 SA-β-Gal staining of mice hippocampal neurons for young group，aging group and EGCG treatment group

小鼠脑组织NF-κB-P65 和IκBα(Y42)蛋白表达情况如图4 所示。年轻组小鼠脑组织IκBα 蛋白表达较高，而NF-κB 蛋白表达较低，当利用D-半乳糖诱导衰老后，IκBα 蛋白表达受到明显抑制(P＜0.05);而NF-κB 蛋白表达被激活，与年轻组相比，NF-κB 表达升高了2.03 倍(P＜0.05)。1 mg/(kg·d)的EGCG 处理衰老模型组小鼠5 w 后，与衰老组相比，IκBα 蛋白表达呈上调趋势，NF-κB 蛋白表达被抑制。所以，EGCG 能阻滞衰老所引起的NFκB 蛋白的激活。

图5 小鼠脑组织NF-κB 和IκBα 蛋白表达分析Fig.5 Protein expression changes of IκB-α and NF-κB of mice brain tissue for young group，aging group and EGCG treatment group

3 讨论

细胞衰老(cellular aging)是一个极其复杂的生物学过程，主要指正常细胞在不能分裂后所进入的状态。此时细胞仍然是存活的，但细胞的基因和蛋白的表达谱发生了很大改变，从而出现细胞形态、结构以及细胞内酶活性改变等一系列现象。目前，关于人体衰老机制研究主要包括两大学说，即氧化损伤学说和端粒学说。其中氧化损伤学说及作用机制已经在不同研究中得到证明。过量氧自由基可以导致各种大分子如DNA，蛋白质的氧化损伤，从而造成基因表达紊乱和蛋白质的损伤，引起机体衰老［10］。D-半乳糖已被证明，在不同动物中均可以通过增加氧化强度，降低抗氧化酶的活性和线粒体的作用来加速衰老。所以，D-半乳糖被广泛用于衰老模型的构建。本实验中，连续9 w 每天于小鼠颈部皮下注射约250 μg 的D-半乳糖，经小鼠行为学检测，外周血SOD 活性及脑组织海马区SA-β-Gal 染色检测发现D-半乳糖能显著引起小鼠氧化损伤，从而成功建立小鼠衰老模型。

有研究表明，EGCG 处理人源性肝癌细胞系HCCLM6 后，能引起广泛细胞凋亡的发生［11］。所以，EGCG 与炎症发生和细胞凋亡存在密切关系。研究人员一直认为，炎症不只是衰老发生的一个旁观者，其很可能加快了衰老的进程，但具体分子机制报道较少。2013 年，美国一研究小组揭示:年轻小鼠下丘脑中NF-κB 几乎不具有活性，随着衰老的进程，下丘脑中的NF-κB 被逐渐激活［8］。所以，下丘脑中的炎症有可能是整个身体衰老的根源，其与NF-κB 激活程度相关。本研究发现，EGCG 处理后，抑制了小鼠脑组织NF-κB 的表达，而IκBα 蛋白表达有上调趋势。所以，EGCG 很可能通过阻碍NF-κB 的表达而延迟衰老进程。核转录因子NF-κB在细胞活动过程中是一个重要的调节因子，参与免疫反应，细胞增殖，分化和凋亡等相关400 多个基因转录的调控［4，12］。NF-κB 的激活涉及IκB 的磷酸化，而后者有赖于IKK(IκB 激酶)的调控。在哺乳动物中，IκB 蛋白是NF-κB 主要抑制剂，主要包括IκBα、IκBβ 和IκBγ 三种因子［13］。所以，EGCG 可能通过刺激IκBα 的表达而抑制NF-κB 的活化，进而延缓了衰老进程。但此推论还需要通过磷酸化IκBα 蛋白表达以及细胞核内磷酸化NF-κB-P65 的表达变化进一步得到验证。因此，本研究发现EGCG 具有明显抗衰老作用，其机制可能通过抑制NF-κB 的表达而阻碍了细胞衰老的进程。该研究结果为EGCG 相关的抗衰老保健品开发提供了一个新的方向。

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