白木香内生真菌Botryosphaeria rhodina A13 固体发酵产物的分离鉴定

张 瑶，陶美华，陈玉婵，郁建平，章卫民*

1贵州大学，贵阳 550025;2 广东省微生物研究所 省部共建华南应用微生物国家重点实验室广东省菌种保藏与应用重点实验室 广东省微生物应用新技术公共实验室，广州 510070

内生真菌(endophytic fungi)通常是指生长在健康植物体根、茎、叶等组织细胞间隙或者细胞内对植物体没有明显病害的真菌，是植物微生态系统的重要组成部分［1］。近年来研究表明，植物内生真菌能够产生多种结构类型的活性代谢产物［2］。来源于药用植物的内生真菌能够产生和宿主植株相同或者相似的生物活性物质，因此药用植物内生真菌是发现天然活性物质的重要资源。

据报道，葡萄座腔菌属真菌Botryosphaeria rhodina 能产生结构新颖的抗菌和抗肿瘤活性代谢产物［3，4］。本研究前期从药用植物白木香［Aquilaria sinensis (Lour.)Gilg.］中分离获得一株内生真菌Botryosphaeria rhodina A13［5］，经离体实验表明，该菌株能诱导离体白木香树枝产生沉香倍半萜组分5，9-二甲基-2-(1-甲基亚乙基)-环癸醇［6］。为了研究该株内生真菌的活性代谢产物，本研究以白木香木屑为培养基质对菌株A13 进行固体发酵培养，并对其发酵产物进行分离纯化和结构鉴定，从中分离得到10 个化合物，分别鉴定为:豆甾-4-烯-3-酮(1)、豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮(2)、豆甾-4-烯-3，6-二酮(3)、(22E，24S)-5α，6α-环氧基-24-甲基胆甾-8(14)，22-二烯-3β，7α-二醇(4)、5，4＇-二羟-7-甲氧基黄酮(5)、香草酸(6)、对甲氧基苯甲酸(7)、尿嘧啶(8)、2-甲氧基对苯二酚(9)、2-甲基-3，5-羟基色酮(10)。所有化合物均为首次从该属真菌中分离得到。

1 材料与仪器

1.1 菌株和细胞株

内生真菌B.rhodina A13 分离自30 年生的白木香［5］，供试肿瘤细胞株为乳腺癌细胞MCF-7 和大细胞肺癌细胞NCI-H460，均保藏于广东省微生物菌种保藏中心。

1.2 试剂

柱色谱硅胶(100～200 目、200～300 目，青岛海洋化工厂)、GF254高效薄层硅胶板(Merck 公司)，C18反相硅胶(40～75 μm，Fuji Silysia Chemical Ltd.)，凝胶Sephadex LH-20(18～110 μm，Amersham Biosciences Ltd.)，其余试剂均为分析纯，购自广州化学试剂厂。

1.3 仪器

LRH-100 生化培养箱(韶关市泰宏医疗器械有限公司)，AVANCE III 型500 MHz 核磁共振波谱仪(Bruker 公司)，API 2000 LC/MS/MS 质谱仪(MDS SCIEX 公司)，DSQII 型电子轰击电离质谱仪(美国Thermo 公司)，LC-20AT 型高效液相色谱仪(日本岛津公司)，ZF-6 型三用紫外线分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)，Hangping FA2004N 电子天平(上海精密科学仪器有限公司)，RE-2000 型旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)，超净工作台(上海恒益科技有限公司)。

2 实验方法

2.1 发酵培养

在白木香木屑中加入适量水拌匀，使含水量达60%左右，分装至聚丙烯食用菌袋，每袋约装100 g木屑，共100 袋，121 ℃灭菌30 min，冷却后挑取适量B.rhodina A13 菌丝体接种于菌袋中，在黑暗条件下27 ℃培养38 d。

2.2 发酵产物的提取与分离

将固体发酵产物用95%乙醇浸提3 次，浓缩得发酵物提取物，加入适量水悬浮，先用石油醚萃取5次，至上层液澄清，40 ℃下减压浓缩，得浸膏26.7 g，再用乙酸乙酯萃取5 次，至上层液澄清，40 ℃下减压浓缩，得浸膏71.1 g。两种浸膏分别过硅胶柱，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱，用薄层色谱(TLC)检测(显色剂为茴香醛-浓硫酸试剂)，合并相似组分，石油醚萃取部分得到39 个组分(P1～P39)，乙酸乙酯部分得到39 个组分(E1～E39)。P11 组分用甲醇反复重结晶得到化合物1(18.0 mg)。重结晶后P11 剩余组分经Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，正相硅胶柱(石油醚-乙酸乙酯4∶1)，制备薄层色谱得化合物2(1.6 mg)。P14 组分经Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，用甲醇反复重结晶得到化合物3(2.0 mg)。P30 组分经Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，反相硅胶柱层析(甲醇-水70∶30)，正相硅胶柱(石油醚-乙酸乙酯2∶1～1∶2 和乙酸乙酯)，制备薄层色谱得化合物4(20.0 mg)。E23 组分经Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱得到亚组分E23-3～E23-4，E23-3 组分用甲醇反复重结晶得化合物5(1.0 mg)，E23-4 组分经反相硅胶柱层析(甲醇-水40∶60)得化合物6(5.5 mg)。E15 组分经Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，反相硅胶柱层析(甲醇-水30∶70)，用甲醇反复重结晶得化合物7(1.3 mg)。E34 组分经Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，用甲醇反复重结晶得化合物8(1.5 mg)。E25 组分经Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，反相硅胶柱层析(甲醇-水20∶80)，制备薄层色谱得化合物9(2.0 mg)。E21组分经Sephadex LH-20 以二氯甲烷-甲醇(1∶1)洗脱，反相硅胶柱层析(甲醇-水20∶80)，用甲醇反复重结晶，制备薄层色谱得化合物10(5.2 mg)。

2.3 细胞毒活性测定

采用SRB 法［7］测定化合物4 的细胞毒活性。取对数生长期的乳腺癌细胞MCF-7 和大细胞肺癌细胞NCI-H460，用胰酶消化，台盼蓝染色计数，台盼蓝排斥实验检测细胞活力大于95%后，用新鲜培养基调整细胞浓度为3 ×104个/mL，细胞接种于96 孔板，每孔加入180 μL 的细胞悬液，并设3 个空白孔调零，于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h。待细胞贴壁后，每孔加入20 μL 待测样品，空白(阴性)对照加20 μL 培养基，以顺铂作阳性对照。置CO2培养箱中培养72 h 后，加入50 μL 50%冷三氯醋酸固定细胞，4 ℃放置1 h 后用蒸馏水洗涤5 次，空气中自然干燥。然后每孔加入由1%冰醋酸配制的浓度为4 mg/mL 的SRB 溶液100 μL，室温中染色30 min，去上清，用1%冰醋酸洗涤5 次，空气干燥。最后每孔加入浓度为10 mmol/mL 的Tris 溶液200 μL，用酶标仪测定570 nm 处的吸光值(A)，用以下公式计算样品对细胞生长的抑制率，采用SigmaPlot 10.0 软件计算IC50值。

3 实验结果

3.1 结构鉴定

化合物1 白色晶体;ESI-MS m/z:413 ［M +H］+，分 子 式 为C29H48O。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:5.72 (1H，s，H-4)，1.18 (3H，s，H-19)，0.92 (3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.86 (3H，t，J=7.5 Hz，H-29)，0.84 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.82 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.71 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:200.6 (C-3)，172.6 (C-5)，124.6 (C-4)，56.9 (C-14)，56.8 (C-17)，54.7 (C-9)，46.7 (C-24)，43.3 (C-13)，40.5(C-12)，39.5 (C-10)，37.0 (C-20)，36.6 (C-1)，36.5 (C-8)，34.9 (C-22)，34.8 (C-7)，33.9 (C-6)，33.0 (C-23)，30.0 (C-2)，29.1 (C-25)，26.9(C-16)，25.1 (C-15)，24.0 (C-28)，21.9 (C-11)，20.7 (C-27)，19.9 (C-19)，19.6 (C-21)，18.3 (C-26)，12.9 (C-18)，12.9 (C-29)。以上数据与文献报道基本一致［8］，确定其结构为豆甾-4-烯-3-酮。

化合物2 白色粉末;EI-MS m/z:428 ［M］+，分子式为C29H48O2。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:6.14 (1H，s，H-6)，4.33 (1H，m，H-3)，1.30 (2H，m，H-28)，1.23 (3H，s，H-19)，0.97 (3H，d，J=6.6 Hz，H-21)，0.89 (3H，t，J=7.5 Hz，H-29)，0.88 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.77 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:202.0 (C-7)，175.4 (C-5)，119.7(C-6)，68.6 (C-3)，56.9 (C-14)，56.5 (C-17)，54.8 (C-9)，46.8 (C-24)，43.1 (C-13)，41.9 (C-4)，40.4 (C-12)，39.8 (C-10)，36.9 (C-1)，36.9(C-20)，34.9 (C-8)，34.5 (C-22)，34.0 (C-2)，29.7 (C-25)，28.8 (C-16)，26.6 (C-23)，24.7 (C-15)，23.6 (C-28)，21.6 (C-11)，19.7 (C-26)，18.9(C-27)，18.7 (C-21)，18.0 (C-19)，11.8 (C-29)，11.8 (C-18)。以上数据与文献报道基本一致［9］，确定其结构为豆甾-5-烯-3β-醇-7-酮。

化合物3 白色固体;EI-MS m/z:426 ［M］+，分子式为C29H46O2。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:6.18 (1H，d，J=0.86 Hz，H-4)，1.17 (3H，s，H-19)，0.95 (3H，d，J=6.5 Hz，H-21)，0.87 (3H，t，J=7.5 Hz，H-29)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-27)，0.85 (3H，d，J=6.8 Hz，H-26)，0.73 (3H，s，H-18);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:203.3 (C-6)，200.5 (C-3)，162.0 (C-5)，126.4 (C-4)，57.5 (C-17)，56.8 (C-14)，51.9 (C-8)，47.7 (C-7)，46.7(C-24)，43.4 (C-13)，40.7 (C-10)，40.0 (C-12)，36.9 (C-20)，36.4 (C-1)，35.1 (C-8)，34.9 (C-2)，34.7 (C-22)，30.0 (C-25)，28.9 (C-16)，26.9(C-23)，24.9 (C-15)，24.0 (C-28)，21.8 (C-11)，20.7 (C-26)，19.9 (C-27)，19.6 (C-21)，18.4 (C-19)，12.9 (C-29)，12.8 (C-18)。以上数据与文献报道基本一致［10］，确定其结构为豆甾-4-烯-3，6-二酮。

化合物4 白色固体;ESI-MS m/z:451 ［M +Na］+，分子式为C28H44O3。1H NMR (500 MHz，CDCl3)δ:5.23 (1H，m，H-23)，5.21 (1H，m，H-22)，4.43 (1H，d，J=3.6 Hz，H-7)，3.96 (1H，m，H-3)，3.15 (1H，d，J=3.6 Hz，H-6)，2.36 (1H，m，H-9)，2.12 (1H，m，H-20)，1.87 (1H，m，H-24)，1.03 (3H，d，J=6.9 Hz，H-21)，0.93 (3H，d，J=6.9 Hz，H-24＇)，0.88 (3H，s，H-18)，0.87 (3H，s，H-19)，0.85 (3H，d，J=7.0 Hz，H-27)，0.83 (3H，d，J=7.0 Hz，H-26);13C NMR (125 MHz，CDCl3)δ:153.5 (C-14)，136.2 (C-22)，133.2 (C-23)，126.1(C-8)，69.6 (C-3)，68.7 (C-5)，66.0 (C-7)，62.2(C-6)，57.7 (C-17)，43.9 (C-24)，43.7 (C-13)，40.5 (C-20)，40.2 (C-9)，39.6 (C-4)，37.5 (C-12)，36.7 (C-10)，34.0 (C-25)，33.1 (C-1)，32.0(C-2)，28.1 (C-16)，25.9 (C-15)，22.1 (C-21)，20.9 (C-24＇)，20.6 (C-26)，19.9 (C-27)，19.0 (C-11)，18.5 (C-18)，17.4 (C-19)。以上数据与文献报道基本一致［11］，确定其结构为(22E，24S)-5α，6α-环氧基-24-甲基胆甾-8(14)，22-二烯-3β，7α-二醇。

化合物5 黄色固体;ESI-MS m/z:285 ［M +H］+，分子式为C16H12O5。1H NMR (500 MHz，DMSO)δ:12.96 (1H，s，5-OH)，10.39 (1H，s，4＇-OH)，7.96 (2H，m，H-2＇，6＇)，6.93 (2H，m，H-3＇，5＇)，6.85 (1H，s，H-3)，6.77 (1H，d，J=2.2 Hz，H-8)，6.37 (1H，d，J=2.2 Hz，H-6)，3.86 (3H，s，7-OCH3);13C NMR (125 MHz，DMSO)δ:183.3 (C-4)，166.5 (C-7)，165.4 (C-2)，162.7 (C-4＇)，162.6(C-5)，158.6 (C-8a)，129.9 (C-2＇，6＇)，122.4 (C-1＇)，117.3 (C-3＇，5＇)，106.0 (C-4a)，104.4 (C-3)，99.3 (C-6)，94.1 (C-8)，57.4 (7-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致［12］，确定其结构为5，4＇-二羟基-7-甲氧基黄酮。

化合物6 白色粉末;EI-MS m/z:168 ［M］+，分子式为C8H8O4。1H NMR (500 MHz，DMSO)δ:7.45 (1H，s，H-2)，7.41 (1H，d，J=8.0 Hz，H-6)，6.79 (1H，d，J=8.0 Hz，H-5)，3.77 (3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，DMSO)δ:151.5 (C-4)，148.3 (C-3)，124.5 (C-6)，116.1 (C-2)，114.3(C-5)，56.8 (-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致［13］，确定其结构为香草酸。

化合物7 白色粉末;ESI-MS m/z:151 ［MH］-，分子式为C8H8O3。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:7.97 (2H，d，J=8.9 Hz，H-2，6)，6.94 (2H，d，J=8.9 Hz，H-3，5)，3.85 (3H，s，-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致［14］，确定其结构为对甲氧基苯甲酸。

化合物8 黄色固体;ESI-MS m/z:113 ［M +H］+，111 ［M-H］-，分子式为C4H4N2O2。1H NMR(500 MHz，DMSO)δ:11.01 (1H，br s)，10.82 (1H，br s)，7.38 (1H，d，J=7.6 Hz，H-6)，5.44 (1H，d，J=7.6 Hz，H-5);13C NMR (125 MHz，DMSO)δ:165.7 (C-1)，152.9 (C-3)，143.6 (C-5)，101.6 (C-6)。以上数据与文献报道基本一致［15］，确定其结构为尿嘧啶。

化合物9 黄色粉末;ESI-MS m/z:304 ［2M +Na+H］+，320 ［2M+K+H］+，分 子 式 为C7H8O3。1H NMR (500 MHz，MeOD)δ:7.58 (1H，d，J=1.2 Hz，H-3)，7.50 (1H，d，J=8.2 Hz，H-6)，6.77 (1H，dd，J=8.2，1.2 Hz，H-5)，3.89(3H，s，-OCH3);13C NMR (125 MHz，MeOD)δ:150.0 (C-4)，147.7 (C-2)，128.6 (C-1)，123.9 (C-6)，114.8 (C-5)，113.5 (C-3)，55.8 (-OCH3)。以上数据与文献报道基本一致［16］，确定其结构为2-甲氧基对苯二酚。

化合物10 无色油状液体;ESI-MS m/z:193［M-H］-，分子式为C10H10O4。1H NMR (500 MHz，CD3OD)δ:7.58 (1H，dd，J=7.5，8.4 Hz，H-7)，7.08 (1H，d，J=7.5 Hz，H-8)，6.94 (1H，dd，J=8.3，0.8 Hz，H-6)，4.56 (2H，m，H-2，H-3)，1.47(3H，d，J=6.3 Hz，CH3-2);13C NMR (125 MHz，CD3OD)δ:169.7 (C-4)，162.4 (C-5)，143.6 (C-8a)，137.3 (C-7)，117.3 (C-6)，117.2 (C-8)，107.5 (C-4a)，81.1 (C-2)，69.0 (C-3)，17.7 (C-2a)。以上数据与文献报道基本一致［17］，确定其结构为2-甲基-3，5-羟基色酮。

3.2 细胞毒活性

细胞毒活性测试结果表明，化合物4 对肿瘤细胞株MCF-7 和NIC-H460 的IC50分别为34.22 μg/mL 和37.97 μg/mL(表1)。

表1 化合物4 对2 种肿瘤细胞株的IC50值Table 1 IC50values of compound 4 against two tumor cell lines

4 讨论

葡萄座腔菌属(Botryosphaeria)真菌是农林业上重要的病原菌、内生真菌或潜在的致病菌，能产生具有细胞毒活性、抗菌活性等次级代谢产物［3，4］。如黄玖利从海南粗榧内生真菌葡萄座腔菌S15 的发酵产物中分离得到具有抑制人慢性髓原白血病细胞K562 活性的化合物［18］。本研究从药用植物白木香内生真菌B.rhodina A13 的固体发酵产物中分离鉴定了10 个化合物，它们均为首次从该属真菌中分离得到。化合物5 为黄酮类化合物，具有抗口腔表皮样癌细胞KB 作用，此化合物的多个衍生物具有显著的抗KB 细胞和抑制DNA 拓扑异构酶I 活性［12］。化合物1～4 是甾体类化合物，活性测试结果表明化合物4 有细胞毒活性。

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