过表达PNP 对肌苷生产菌合成利巴韦林的影响

杨书尧，刘 莉，马跃超，陈 宁，谢希贤

(代谢控制发酵技术国家地方联合工程实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457)

利巴韦林，化学名1–β–D–呋喃核糖基–1,H–1，2，4–三氮唑–3–羧氨酰，又名病毒唑，是一种高效广谱的核苷类抗病毒药物，对多种DNA 和RNA 病毒均有较好的抑制作用[1].利巴韦林的生产方法有化学合成法、酶催化法和微生物发酵法.目前化学合成法是合成利巴韦林的主要生产方法，但是化学合成法步骤繁琐、条件苛刻.酶催化法主要是利用嘌呤核苷磷酸化酶(PNP)催化底物核苷或D–核糖–1–磷酸酯与1，2，4–三氮唑–3–羧氨酰(TCA)反应，直接合成利巴韦林[2].虽然酶催化法可以简化反应步骤、条件简单，但诱导剂的添加提高了生产成本且不利于后续的分离纯化.发酵法合成利巴韦林原料简单、污染小，具有工业化生产的潜力.古屋晃等[3]利用产核苷的枯草芽孢杆菌属和短杆菌属的微生物进行发酵培养积累利巴韦林，但利巴韦林产量小于1,g/L.武改红等[4]以鸟苷产生菌枯草芽孢杆菌TM903 为供试菌，在5,L 发酵罐发酵60,h 积累利巴韦林5.86,g/L.谢希贤等[5]利用枯草芽孢杆菌 TM903 和谷氨酸棒杆菌TL1105 进行发酵罐混菌发酵，采用变温控制模式和分阶段供氧控制模式发酵60,h，利巴韦林产量达到5.96,g/L.

PNP 是嘌呤核苷补救合成途径的关键酶之一，该酶的主要功能是催化核苷分解为核糖–1–磷酸和相应的嘌呤碱基.在体外反应时，若加入另外一种嘌呤碱基或其类似物，可以合成新的嘌呤核苷或其类似物，现已广泛用于酶催化法生产核苷类抗病毒药物[6].Bzowska 等[7]根据PNP 底物专一性和相对分子质量大小的不同将PNP 分为低相对分子质量同源三聚体类和高相对分子质量同源六聚体类.某些微生物会同时存在两种聚体的PNP，如枯草芽孢杆菌.

影响发酵法合成利巴韦林的主要因素是前体物核苷和PNP.理论上嘌呤核苷和嘧啶核苷都可作为利巴韦林的合成前体，但综考虑生产成本与PNP 的催化效率，嘌呤核苷更合适.研究表明，肌苷是PNP的最适底物[8].本文以肌苷生产菌枯草芽孢杆菌B.,subtilis Q60 为出发菌，通过基因工程技术提高PNP 的表达量，比较了两种PNP 的催化效率.

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种、质粒和培养基

肌苷生产菌枯草芽孢杆菌(B.,subtilis)Q60、枯草芽孢杆菌(B.,subtilis)168、大肠杆菌(E.,coli)DH5α和质粒pBE43(大肠杆菌–枯草芽孢杆菌穿梭质粒，含有P43 启动子)、pBSA43(大肠杆菌–枯草芽孢杆菌穿梭质粒，含有 P43 启动子和 sacB 基因信号肽)、pWB980 (枯草芽孢杆菌质粒，含有P43 启动子和sacB 信号肽)均为本实验室保藏.

活化斜面培养基(g/L)：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏10，酵母膏5，NaCl 2.5，琼脂20，pH 7.0～7.2.

种子培养基(g/L)：葡萄糖20，蛋白胨10，酵母浸膏15，玉米浆12，NaCl 2.5，尿素2，pH 7.0～7.2.

发酵培养基(g/L)：葡萄糖140(单独灭菌)，玉米浆16，酵母粉15，(NH4)2SO4,22，MgSO4·7H2O,5，KH2PO4,5，CaCO320，pH 7.0～7.2.

1.1.2 试剂及仪器

限制性内切酶 Kpn Ⅰ、Sal Ⅰ和 Xho Ⅰ，Fermentas 公司；Solution Ⅰ、Taq DNA 聚合酶、1,kbp DNA Ladder，大连宝生物工程有限公司；普通琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒，天津为科生物有限公司；TCA，纯度99%，山东阳成生物科技有限公司；其他试剂为国产分析纯试剂.

PCR 仪，Bio-Rad 公司；SBA–40C 型生物传感仪，山东生物科学研究所.DNA 序列分析比较采用DNAMAN 2.0 软件，引物设计采用Primer Premier 5软件，电泳图分析采用Image master Total Lab v1.00软件.

1.2 实验方法

1.2.1 过表达PNP 质粒的构建

根据B.,subtilis 168 的deoD 的基因序列(Gene ID：940038)和pupG 的基因序列(Gene ID：938731)设计引物，见表1.PCR 反应体系：首先94,℃预变性3,min，然后95,℃变性30,s，58,℃退火30,s，72,℃延伸60,s，进行30 轮循环扩增，最后一个循环完成后，72,℃继续延伸10,min.质粒构建流程：(1)使用引物deoDin-S 和deoD-A 扩增deoD 基因片段，Kpn Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切后连接到载体pBE43，构建deoD 胞内表达质粒pBEdeoD.(2)使用引物pupGin-S 和pupGA 扩增pupG 片段，Kpn Ⅰ和SalⅠ双酶切后连接到载体pBE43，构建pupG 胞内表达质粒pBEpupG.(3)以质粒pWB980 为模板，引物sacB-S 和sacB-A 扩增sacB 信号肽序列(144,bp)；引物deoD-S 和deoD-A扩增deoD 基因，通过重叠PCR 将sacB 信号肽与deoD 连接，KpnⅠ和SalⅠ双酶切后连接到载体pBE43，构建分泌表达质粒pBSAdeoD.(4)pupG-S和pupG-A 扩增pupG 片段，XhoⅠ和SalⅠ双酶切后连接到载体pBSA43，构建分泌表达质粒pBSApupG.所有连接产物转化大肠杆菌DH5α，提取阳性转化子质粒进行双酶切验证，并送华大基因公司测序.

1.2.2 过表达PNP 重组菌的构建

将4 个重组质粒分别电转化导入肌苷生产菌B.,subtilis Q60[12]，37,℃培养，次日挑取转化子，提取质粒，进行双酶切验证，正确的分别命名为过表达PNP 菌株Q60/pBEdeoD 和Q60/pBEpupG；分泌过表达PNP 菌株Q60/pBSAdeoD 和Q60/pBSApupG.

表1 本研究所用引物Tab.1 Primers in this study

1.2.3 重组菌发酵生产利巴韦林

将4 个重组菌株和只含有空质粒pBE43 的对照菌株进行500,mL 摇瓶发酵实验.

活化培养：取斜面保藏菌种划线接种于活化斜面，32,℃培养12～14,h，转接后重复1 次.

种子培养：从新鲜活化斜面上挑取两环菌体接入种子培养基中，500,mL 三角瓶装液量为 30,mL，10,μg/mL 卡纳霉素抗性，32,℃、200,r/min 振荡培养8～10,h 至A600＝8～10.

发酵培养：10%接种量，36,℃、200,r/min 振荡培养96,h.从发酵12,h 开始每隔12,h 添加0.2,g TCA，共添加3 次.

1.2.4 分析方法

发酵过程中每12,h 测定波长600,nm 下的吸光度.采用SBA–40C 型生物传感仪测定发酵液中残糖：将发酵液离心，取上清液，用去离子水稀释100倍后，取25,μL 稀释液进样直接读数.采用高效液相色谱法测定发酵液中的利巴韦林和肌苷含量：色谱柱为Kromasil C18 柱(250,mm×416,mm，5,μm).利巴韦林测定条件：发酵液用离子水稀释100 倍，流动相为V(乙腈)∶V(水)＝4∶96 的乙腈水溶液，流量1.0,mL/min，柱温18.5,℃，检测波长207,nm.肌苷测定条件：发酵液用1,mol/L NaOH 溶液稀释10 倍，沸水浴5,min 后离心取上清液，上清液用去离子水稀释100 倍，流动相为V(乙腈)∶V(水)＝10∶90 的乙腈水溶液，流量 1.0,mL/min，柱温 25,℃，检测波长248,nm.

2 结果与分析

2.1 重组质粒和重组菌株的构建及鉴定

胞内过表达质粒pBEdeoD、pBEpupG 和分泌过表达质粒pBSAdeoD、pBSApupG 的酶切验证结果如图1 所示.图1(a)中，pBEdeoD 用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后在800,bp 左右出现目的条带.pBEpupG 用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后在830,bp 左右出现目的条带，与预期相符.图1(b)中，pBSAdeoD 用KpnⅠ和SalⅠ双酶切后在870,bp 左右出现目的条带，符合sacB 信号肽序列和 deoD 重叠后的片段大小.pBSApupG 用XhoⅠ和SalⅠ双酶切后在830,bp左右出现目的条带，与预期相符.重组质粒测序，结果与GenBank 上报道的基因序列一致.

图1 pBEdeoD、pBEpupG、pBSAdeoD 和pBSApupG 的验证Fig.1 Identification of the recombined plasmids pBEdeoD，pBEpupG，pBSAdeoD and pBSApupG

2.2 重组菌发酵合成利巴韦林

为了研究两种结构的PNP 在肌苷生产菌中过表达以及不同的表达方式对合成利巴韦林的影响，将4株重组菌株和只含有pBE43 空质粒的对照菌进行摇瓶发酵实验，定期取样测定菌体生长吸光度、肌苷和利巴韦林的产量，发酵过程曲线如图2 所示.

图2 利巴韦林摇瓶发酵过程曲线Fig.2 Fermentation parameters of ribavirin

结果显示：4 株重组菌的菌体干质量都小于对照菌，胞外分泌过表达重组菌 Q60/pBSAdeoD 和Q60/pBSApupG 减少明显，而且这两株菌的对数期缩短，20,h 后即进入平稳期；而胞内表达重组菌Q60/pBEdeoD 和Q60/pBEpupG 与对照菌相似，在40,h 左右才进入平稳期.其原因可能是酶的过表达给菌体的生长造成了不同程度的负担.对照菌从10,h 开始积累肌苷，产量平稳上升，发酵80,h 后趋于平缓.对照菌在添加TCA 后开始有少量的利巴韦林积累，但是积累量保持在2,g/L，不随着肌苷的增长而上升.4 株重组菌株的肌苷含量与对照菌相比则明显减少，添加TCA 后，利巴韦林合成量明显增长，PNP816重组菌Q60/pBEpupG 和Q60/pBSApupG 的增长程度较大.PNP702重组菌 Q60/pBEdeoD 和Q60/pBSAdeoD 的利巴韦林合成趋势虽然与前者一致，但是合成量低20%左右.另外，相同的PNP 采用分泌过表达利巴韦林合成量比胞内过表达高.

4 株重组菌的利巴韦林产量是对照菌的4～6倍；肌苷剩余量仅为对照菌的15%～30%，说明过表达PNP 可以提高利巴韦林的合成效率.重组菌的利巴韦林产量、肌苷转化率和TCA 利用率见表2.

表2 重组菌的核苷总产量及转化率比较Tab.2 Comparison of the yields of total nucleoside and inosine utilization of the recombined strains

由表2 可以看出重组菌Q60/pBEpupG 的利巴韦林产量比Q60/pBEdeoD 高32.5%；Q60/pBSApupG的利巴韦林产量比Q60/pBSAdeoD 高39.6%，说明过表达PNP816更有利于利巴韦林的合成.胞外分泌型过表达重组菌Q60/pBSAdeoD 的产量比Q60/ pBEdeoD 高9.6%；Q60/pBSApupG 比Q60/pBEpupG 高15.5%，4 株重组菌的TCA 利用率也呈现同样的趋势，与对照菌相比，分别提高了3.2～5.5 倍，说明PNP 的分泌表达有利于利巴韦林的合成.

3 讨论

发酵法合成利巴韦林需要核苷作为前体物，PNP作为催化剂.研究表明3 种嘌呤核苷中肌苷是最适底物，所以本研究以肌苷生产菌作为出发菌，构建4株不同类型的PNP 过表达菌株，通过外源添加TCA的方法将利巴韦林的合成和肌苷的发酵相偶联，随着菌体生长、前体物肌苷的积累和酶的表达，实现一步法合成利巴韦林.

发酵结果显示，在肌苷生产菌中过表达PNP816利巴韦林的合成效率和底物TCA 的利用率都高于PNP702，这与已发表的研究结果一致.Xie 等[9]发现当以肌苷作为反应底物时，PNP702和PNP816的酶促动力学参数Km值分别为(1.23±0.01),μmol/L 和(0.31±0.01),μmol/L，PNP816具有更强的亲和力，所以利巴韦林产量更高.另外三聚体酶蛋白每形成1 个具有催化活性的酶分子需要3 条肽链；而六聚体酶蛋白每形成1 个具有催化活性的酶分子需要6 条肽链，当利用同样的表达质粒，在同样的发酵条件下，相同时间的转录量相近，三聚体形成具有催化活性的酶分子所需要的能量少于六聚体，效率更高[10].

利巴韦林的合成过程中外源添加的底物TCA 存在于发酵液中，将PNP 分泌到胞外可能会提高反应效率，实验结果也显示分泌过表达重组菌的利巴韦林产量和TCA 的利用率都高于胞内表达的重组菌，但是肌苷的利用率并没有胞内表达高.利巴韦林是核苷类似物，含有1 分子5–磷酸核糖，从两种核苷类产物的总量上看，分泌表达比胞内表达积累的核苷总量更高，可能原因是底物肌苷直接与TCA 在胞外进行反应，减少了TCA 跨膜输入和利巴韦林跨膜输出的消耗，菌株的负担更小.转化率低的可能性是酶的表达方式不同，导致酶量和活性方面存在差异；另外，胞内和胞外的催化环境不同，酶的催化活性也可能受到了影响[11].

研究表明[12]：当催化以肌苷为底物反应时的催化活性设定为酶活标准(100%)时，PNP702催化鸟苷的活性为46.2%；PNP816催化鸟苷的活性为87.7%；等质量的纯化重组PNP 在磷酸盐缓冲液中以鸟苷为核糖基供体时两种酶的利巴韦林终产率均略高于肌苷.理论上鸟苷的分解产物鸟嘌呤较肌苷的分解产物次黄嘌呤溶解性低，有利于反应向利巴韦林合成方向进行[13]；但是目前还未见通过改造鸟苷生产菌提高PNP 活性来研究利巴韦林合成的相关报道.因此，今后的研究方向可以考虑以鸟苷作为核苷前体物，对鸟苷高产菌进行改造，提高其PNP 的酶活性，研究对利巴韦林合成的影响.

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