山茱萸对肾间质纤维化的保护作用及机制研究

陈 烨，朱春玲，严 瑞，刘晓霞，宋文玉

贵州医科大学附属医院肾病风湿科，贵阳 550004

慢性肾脏疾病(CKD)常缓慢发展，往往导致广泛的肾间质纤维化(RIF)，最终发展为终末期肾衰。肾脏纤维化的病理学特征主要表现为肾小球硬化、肾小管间质纤维化和肾内血管硬化［1，2］。肾小管间质病变程度对10年肾脏存活率具有决定性影响，对肾脏预后的影响较肾小球病变更为严重。目前，肾间质纤维化尚无有效的治疗方法。因此，寻找有效的能够干预肾间质纤维化的药物，从而减轻或逆转肾间质纤维化，阻止残余肾功能下降显得尤为重要和迫切。本研究通过建立SD 大鼠UUO 模型，观察山茱萸对其肾间质纤维化的影响及其肾组织中YKL-40、β-catenin 等表达的影响，旨在探讨肾间质纤维化的作用机制及山茱萸对其的治疗作用。

1 材料与仪器

1.1 试验动物

7 周龄雄性清洁级SD 大鼠36 只，体重200～250 g，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(渝)2007-0003，使用许可证号:SYXK。

1.2 药品与试剂

山茱萸(贵州省同济堂中药有限公司，批号:120818)。YKL-40(bs-1093R)、β-catenin、SABC 免疫组化试剂盒、DAB 显色剂均购自北京博奥森生物科技有限公司。细胞总蛋白提取试剂盒购自美国Pierce 公司提供;兔抗小鼠Wnt4 和β-catenin、YKL-40、β-actine 一抗、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG 二抗均由美国Cell Signaling 公司提供;ECL 化学发光液由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。

1.3 仪器

组织自动脱水机(型号ZT-12P2)，石蜡包埋机(型号YB-6LF)，石蜡切片机(型号 Leica RM 2235)，电热恒温干燥箱(型号202-O)，生物组织摊烤片机(型号YT-7F)，光学显微镜(型号OLYMPUS BX51)。

2 实验方法

2.1 试剂的配制

山茱萸研磨成粉状，与双蒸水配成混悬液，按300 mg/Kg/d 灌胃，即配即用。

2.2 动物模型制作及分组

参照文献方法［3］进行UUO 模型制备，大鼠适应性饲养1 周后，测体重，尿蛋白阴性后，随机分为假手术组(S 组，12 只)，模型组(U 组，12 只)、山茱萸(300 mg/Kg)干预组(D 组，12 只)，并据造模及药物干预时间再分为U7天组、U14天组、D7天组、D14天组，同时假手术组相应有S7天组、S14天组相对应。模型组(U 组)和山茱萸干预组(D 组)予10%水合氯醛(2 mL/Kg)腹腔注射麻醉后，无菌手术打开腹腔分离左侧输尿管近肾盂端，用4 号线结扎并剪断输尿管，分层缝合关闭腹腔。假手术组(S 组)只分离但不结扎和剪断输尿管。各组大鼠均自由饮水及进食。术后第1 d 开始，用药组(D 组)胃注山茱萸饮片液(300 mg/Kg)，余两组胃注同等量生理盐水。

2.3 标本制作及组织病理学观察

造模后7、14 d 分别处死各组大鼠，取左侧肾脏立即置于10%福尔马林中固定48 h，后再进一步脱水、石蜡包埋、切片(厚度3 μm)等行苏木精-伊红(HE)染色观察肾组织病理改变。Masson 染色观察肾间质纤维化程度。免疫组化染色检测YKL-40、βcatenin 的表达水平。蛋白免疫印记法检测大鼠肾组织Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表达。

2.4 统计学分析

采用SPSS 13.0 软件对数据进行统计学分析处理。计量资料用均数±标准差表示。多组间均数比较采用单因素方差分析(One Way ANOVA)，组间两两比较方差齐者用LSD 法，如方差不齐，采用Tamhane’s T2 法;各项指标之间做Pearson 相关分析。均以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 造模后情况

各组动物存活率均为100%，成功制备UUO 模型，分别于术后7、14 d 取肾，肉眼可观察到手术侧肾脏随着时间推移逐渐增大，颜色较对侧变浅，肾盂肿大明显，肾皮质部分逐渐变薄，其内充满尿液，表明成功建立单侧输尿管梗阻模型。

3.2 SD 大鼠肾脏的组织病理学改变

肉眼观察，S 组大鼠左侧肾脏随着时间推移未发生明显变化，肾脏大小、形态正常，颜色呈深红色，表面光滑无颗粒感，与右侧肾脏无明显差异。模型组及干预组大鼠左侧肾脏体积较同期S 组及右侧肾脏增大，梗阻上段输尿管扩张明显，颜色变暗淡，皮髓质变薄。随着时间的推移，模型组与干预组大鼠梗阻输尿管扩张越来越严重，颜色淡红，皮髓质明显变薄，内含较多尿液。HE 染色显示，S 组各时间点肾小球、肾小管结构正常，肾间质无纤维化、水肿及炎性细胞浸润。U7组肾小管管腔扩张，肾小管上皮细胞可见较多空泡变性，肾间质轻度纤维化、水肿，可见淋巴细胞、单核细胞浸润。U14组肾小管呈囊性扩张，部分萎缩坏死，弥漫性上皮细胞空泡变性，与小管基底膜弥漫性分离，肾间质纤维化程度加重，大量单核细胞、淋巴细胞浸润，可见蛋白尿管型、红细胞管性。D 组各时间点病变同U 组类似，其程度均较同期U 组减轻，但仍较S 组病变重。与S 组比较，U 组的肾小管间质损伤指数(TDI)显著升高(P＜0.05);而经山茱萸干预后，D 组TDI 显著降低，与U 组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图1，表1。

表1 各组大鼠TDI 和TFI 的比较(±S)Table 1 Comparison of TDI and TFI in each group (±S)

表1 各组大鼠TDI 和TFI 的比较(±S)Table 1 Comparison of TDI and TFI in each group (±S)

注:* P ＜0.05 vs S group;▼P ＜0.05 vs U group;▲P ＜0.05 vs D7th day group.

3.3 Masson 染色

S 组可见肾小管肾小球形态结构正常，肾间质无纤维阳性染色，各时间点无明显差异。U7 组肾小管、肾间质可见纤维阳性染色，肾小管轻度节段分离;U14 组较U7 组肾间质纤维阳性染色面积增大，呈束状、网状分布，肾小管弥漫性分离，部分肾小管萎缩。D7 组肾间质亦可见纤维阳性染色，面积较U7 组减少。D14 组肾间质可见纤维阳性染色面积，呈束状、网状分布，肾小管仍有弥漫性分离，肾小管可见萎缩，但程度较U14 组减轻(见图2)。与S 组比较，U 组的肾间质纤维化指数(TFI)显著升高(P＜0.05);而经山茱萸干预后，D 组TFI 显著降低，与U 组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图2，表1。

图2 各组大鼠肾组织Masson 染色(×200)Fig.2 Masson staining of renal tissue in each group (×200)

3.4 免疫组化法检测YKL-40 的表达

S 组肾间质见少量的YKL-40 表达，7、14 d 时两组表达量差异无统计学意义(P＞0.05);U7组可见YKL-40 在肾小球、肾间质、肾小管上皮细胞胞浆均有阳性表达，其阳性染色部位平均光密度值较S7组升高，U14阳性染色部位平均光密度值较S14组升高，差异有统计学意义(P＜0.05);D 组仍可见肾间质、肾小管上皮细胞浆、肾小球YKL-40 的阳性表达，但较U 组同期各个时间点表达显著降低(P＜0.05);但D7组YKL-40 的表达仍高于S7组，差异有统计学意义(P＜0.05)，D14组YKL-40 的表达高于S14组，差异有统计学意义(P＜0.05)。(见图3、表2)。

图3 各组大鼠肾组织免疫组化之YKL-40 的表达Fig.3 IHC of YKL-40 expression in the renal tissues of rats

表2 免疫组化法测定各组大鼠肾组织YKL-40 和β-catenin 表达(±S)Table 2 Expression of YKL-40 and β-catenin in renal tissues of rats with immunohistochemistry(±S)

表2 免疫组化法测定各组大鼠肾组织YKL-40 和β-catenin 表达(±S)Table 2 Expression of YKL-40 and β-catenin in renal tissues of rats with immunohistochemistry(±S)

注:* P ＜0.05 vs S group;▼P ＜0.05 vs U group;▲P ＜0.05 vs D7th day group.

3.5 免疫组化法检测β-catenin 的表达

β-catenin 在S 组各个时间点大鼠肾间质内均可见少量表达，随着时间的推移，β-catenin 的表达未见明显增加，差异无统计学意义(P＞0.05);U 组各个时间点上均可见β-catenin 在肾间质、肾小管上皮细胞上阳性表达，其平均光密度值显著高于S 组同时间点，差异有统计学意义(P＜0.05);U14平均光密度值高于U7平均光密度值，差异有统计学意义(P＜0.05);D 组各个时间点上可见β-catenin 在肾间质及肾小管上皮细胞上阳性表达，但D14平均光密度值显著低于D7光密度值，差异有统计学意义(P＜0.05)，且D14光密度值低于U14光密度值，差异有统计学意义(P＜0.05)。(见图4，表2)。

图4 各组大鼠肾组织免疫组化之β-catenin 的表达Fig.4 IHC of β-catenin expression in the renal tissues of rats

3.6 蛋白免疫印记法检测大鼠肾组织Wnt4 和βcatenin、YKL-40 蛋白表达

与S 组比较，U 组Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表达量显著升高(P＜0.05);而经山茱萸干预后，D 组Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表达量显著降低，与U 组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见图5，表3。

3.7 相关性分析

经相关性分析，TDI 与Wnt4、β-catenin、YKL-40均呈显著正相关(P＜0.001);TFI 与Wnt4、β-catenin、YKL-40 均呈显著正相关(P＜0.001);YKL-40与Wnt4、β-catenin 呈显著正相关(P＜0.001);βcatenin 与Wnt4 呈显著正相关(P＜0.001)。

表3 各组大鼠肾组织蛋白免疫印记之Wnt4 和β-catenin 蛋白、YKL-40 的表达(±S)Table 3 The expression of Wnt4，β-catenin and YKL-40 protein in renal tissues of rats(±S)

表3 各组大鼠肾组织蛋白免疫印记之Wnt4 和β-catenin 蛋白、YKL-40 的表达(±S)Table 3 The expression of Wnt4，β-catenin and YKL-40 protein in renal tissues of rats(±S)

注:* P ＜0.05 vs S group;▼P ＜0.05 vs U group。

图5 各组大鼠肾组织蛋白免疫印迹之Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白的表达Fig.5 Western blotting of Wnt4，β-catenin and YKL-40 in renal tissue of rats

4 讨论

几丁质酶样蛋白YKL-40 是一个相对分子量为40000 的肝磷脂和壳质链接的凝集素。活化的巨噬细胞、中性粒细胞、血管平滑肌细胞、关节炎患者的软骨细胞等多种细胞均可分泌YKL-40。体外实验中，其诱导巨噬细胞及单核细胞成熟，并由后期分化的巨噬细胞和活化的巨噬细胞分泌，与先天免疫系统及胞外基质重塑有关［4，5］。健康人血浆中虽然存在YKL-40，但浓度较为固定，不受生理活动影响。有研究表明，YKL-40 以一种剂量依赖方式刺激组织细胞如成纤维细胞、滑膜细胞及软骨细胞等人体的连接组织细胞增生，同时还可调节成纤维细胞及滑膜细胞的有丝分裂，在细胞外基质形成和基质重构中发挥重要作用。同时，Wnt/β-catenin 信号途径在肾脏胚胎发育和肾脏肿瘤的发生中均起着关键作用。研究发现，在wnt7b 基因敲除的小鼠急性肾损伤模型中发现肾小管损伤严重、上皮细胞再生延迟，提示Wnt7b 可能参与了肾小管上皮细胞损伤后的修复功能［6］。而Wnt 信号通路及其效应器β-cat 被证实在伤口愈合过程中促进纤维增生［7，8］。在UUO大鼠模型中wnt/β-catenin 信号通路异常激活，并参与肾间质纤维化的发生发展。

现代药理研究已知，山茱萸的果肉含山茱萸环烯醚萜总苷、莫罗忍冬苷、熊果酸、没食子酸、维生素A 等，具有调节免疫、抗炎抗氧化、降血糖等作用［9］。研究发现，山茱萸环烯醚萜总苷不仅能显著降低DN 大鼠的尿微量白蛋白，减轻肾脏病理学改变，并可通过抑制氧化应激来保护肾脏组织。体外实验发现，山茱萸环烯醚萜苷对抗AGEs 对肾小球系膜细胞损伤的机制，可能是通过抑制氧化应激保护肾小球系膜细胞免受AGEs 的损害［10］。

本研究结果显示，假手术组大鼠肾组织肾小管上皮及间质细胞中即有少量YKL-40 表达，其平均光密度约为0.0193 ±0.0004，随时间增加表达相对恒定，无明显变化。目前有研究发现健康人血浆中就存在YKL-40，且浓度较为固定，不受生理活动影响［11］，上述实验结果与其他学者观察到的结果一致，说明YKL-40 在正常肾组织中可能起维持特定生理功能的作用。模型组随时间的增加，肾小管上皮及间质细胞中YKL-40 阳性表达明显增强，U7天组与U14天组分别与假手术对应组比较差异有统计学意义(P＜0.05，表2～3)，U7天组与U14天组比较差异有统计学意义(P＜0.05，表2～3)。随着肾间质纤维化的进展，YKL-40 的表达在显著增强的同时，还与Wnt4、β-Cats 呈显著正相关关系，因而提示其可能参与了肾间质纤维化发生发展。提示YKL-40 可能是一个内源性的促纤维化细胞因子。

目前对YKL-40 的研究尚不够深入，其参与的信号转导通路目前尚未明确。Wnt4 及β-catenin 信号通路是重要的反应肾间质纤维化过程的信号通路。模型组各个时间点上均可见β-catenin 在肾间质、肾小管上皮细胞上阳性表达，其平均光密度值显著高于同期假手术组(P＜0.05);U14天组平均光密度值高于U7天组(P＜0.05)，同时，与S 组比较，U组Wnt4 和β-catenin、YKL-40 蛋白表达量显著升高(P＜0.05);而经山茱萸干预后，D 组Wnt4 和βcatenin、YKL-40 蛋白表达量显著降低，与U 组相比，差异具有统计学意义(P＜0.05)。与免疫组化检测结果相一致，提示Wnt4 及β-catenin 信号通路参与了肾间质纤维化的发生发展过程，同时还发现，YKL-40 与β-Cats 呈显著正相关关系(r=0.987，P＜0.001)，提示YKL-40 与该信号通路存在正向联系的可能性极大，但其具体作用环节及机制，以及在此通路中所处的上下游位置，尚待日后进一步深入研究。

研究结果还显示，药物治疗组与同期模型组比较，YKL-40、β-catenin 表达均有所下降(P＜0.05)，说明山茱萸治疗后，肾间质纤维化有所减轻，推测其对肾脏具有一定的保护作用，其机制可能通过减少Wnt4 及β-catenin 信号通路的激活，下调YKL-40 的激活和释放来发挥作用。但本研究仅对YKL-40 在肾间质纤维化中的作用做了初步探索，未对其发病的具体信号通路及作用环节进行深入研究，且缺乏YKL-40 敲除老鼠模型的相关数据作为参照，在下一步的研究中拟通过YKL-40 敲除老鼠模型研究YKL-40 在肾间质纤维化中的作用，以及山茱萸作用的具体通路进行进一步深入研究。

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