氧化苏木素诱导肺癌A549细胞凋亡及对内质网应激通路的影响*

陶黎阳，黎渐英，张建业

(1.广州医科大学基础学院病理教研室，广州 510182；2.中山大学附属第一医院肾内科，广州 510080；3.广州医科大学药学院，广州 510182)

·论 著·

氧化苏木素诱导肺癌A549细胞凋亡及对内质网应激通路的影响*

陶黎阳1，黎渐英2，张建业3

(1.广州医科大学基础学院病理教研室，广州 510182；2.中山大学附属第一医院肾内科，广州 510080；3.广州医科大学药学院，广州 510182)

目的探讨氧化苏木素对人肺癌A549细胞的凋亡作用及其对内质网应激通路的影响。方法采用噻唑蓝(MTT)细胞毒实验检测氧化苏木素对肺癌A549细胞的毒性作用；流式细胞仪检测细胞凋亡的发生；Western blot检测葡萄糖调节蛋白78(GRP78)和细胞质细胞色素C(cyto-c)表达的变化。结果氧化苏木素对人肺癌A549细胞的IC50值为(5.36± 0.62)μmol/L。0、5、10、20 μmol/L的氧化苏木素作用肺癌A549细胞48 h后，细胞凋亡率分别为(1.15±0.32)%、(19.61±4.52)%、(30.18±6.35)%和(39.48±7.44)%，各组间差异有统计学意义(P<0.05)。与对照组比较，5、10和20 μmol/L氧化苏木素作用肺癌A549细胞48 h后，GRP78出现显著的升高，细胞质中的cyto-c也显著增加。结论氧化苏木素通过内质网应激途径诱导了人肺癌A549细胞凋亡。

肺肿瘤；氧化苏木素；A549细胞；内质网应激途径

肺癌是一个全球范围内高发的恶性肿瘤，在我国因为环境污染的加剧，近年来的统计显示其发病呈逐年增加和年轻化的趋势，尽管手术、化疗、放疗及靶向治疗相联合的肺癌综合治疗策略在临床上的使用，但肺癌的5年生存率并没有得到显著的改善，再加上肿瘤多药耐药的产生，肺癌的5年生存率仅仅不到16%[1]。寻找新的抗肺癌药物仍然是目前研究的热点，从中药中寻找抗肿瘤药物在我国有着悠久的历史，氧化苏木素(brazilein)是从中药苏木中分离的一个小分子化合物，以往的研究显示氧化苏木素具有抗肿瘤的活性[2]，本研究观察了氧化苏木素对肺癌的抗肿瘤活性，并探讨了其相关的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人肺癌A549细胞株购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)，DMEM培养基和胎牛血清购于美国Gibco公司，Annexin V/PI凋亡检测试剂盒为联科生物科技公司产品，MTT、二甲基亚砜(DMSO)等化学试剂购于美国Sigma公司，PVDF膜购于美国Millipore公司，葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、细胞色素C(cyto-c)、GAPDH等抗体购自美国Santa Cruz公司，化学发光试剂盒购自美国Cell Signaling公司。

1.2 方法

1.2.1 人肺癌A549细胞培养 人肺癌A549细胞用含10%胎牛血清DMEM培养液(含100 IU/mL的青霉素和链霉素)，在37 ℃ 5% CO2条件下培养，0.4%胰酶消化传代培养。

1.2.2 噻唑蓝(MTT)细胞毒实验 0.4%胰酶消化对数生长期的A549细胞，预冷磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2遍，悬浮于DMEM培养液使浓度致7 500个/mL细胞，取200 μL稀释的细胞接种到96孔板，培养过夜待细胞贴壁后，加入对倍稀释的氧化苏木素，在37 ℃、5% CO2条件下培养68 h，每孔加入MTT使浓度致0.5 mg/mL，37 ℃、5% CO2条件下继续培养4 h，弃去培养液，每孔加入100 μL DMSO溶解MTT结晶，美国Bio-Rad公司的酶标仪(Model 550)540 nm波长处测定吸光度值，计算氧化苏木素对肺癌A549细胞半数抑制浓度(IC50值)。

1.2.3 细胞凋亡的流式细胞仪分析 0.4%胰酶消化对数生长期的A549细胞，预冷PBS洗涤细胞2遍，悬浮于DMEM培养液使浓度致2×104个/mL细胞，取2 mL稀释的细胞接种到6孔板，培养过夜待细胞贴壁后，加入0、5、10、20 μmol/L的氧化苏木素，在37 ℃、5% CO2条件下培养48 h，胰酶(无EDTA)消化收集细胞，预冷PBS洗涤细胞2遍，悬浮于冷PBS使浓度致1×105个/mL细胞，取400 μL稀释的细胞按照试剂盒的要求加入5 μL Annexin V-FITC和5 μL PI，4 ℃避光染色30 min。预冷PBS洗涤细胞2遍，500 mL冷PBS重悬细胞，置冰上待检。凋亡的监测使用美国贝克曼库尔特公司的流式细胞仪(Cytomics FC500)完成，流式软件统计分析凋亡细胞占所有细胞的比率。

1.2.4 细胞总蛋白和胞浆蛋白的提取 0.4%胰酶消化对数生长期的A549细胞，预冷PBS洗涤细胞2遍，悬浮于DMEM培养液使浓度致2×104个/mL细胞，取2 mL稀释的细胞接种到6孔板，培养过夜待细胞贴壁后，加入0、5、10、20 μmol/L的氧化苏木素，在37 ℃、5% CO2条件下培养48 h，胰酶(无EDTA)消化收集细胞，预冷PBS洗涤细胞2遍。细胞总蛋白的提取:取上述获得的细胞沉淀加入1×SDS上样缓冲液裂解细胞，95 ℃ 10 min，10 000×g离心20 min，上清液即为细胞总蛋白。细胞质蛋白的提取:取上述获得的细胞沉淀加入细胞质提取缓冲液，10 min后(期间不断震荡)700 g离心10 min，取上清液10 000×g离心30 min，上清液即为细胞胞质蛋白。

1.2.5 Western blot检测 取上述获得的细胞总蛋白或胞质蛋白进行SDS-PAGE (8%积层胶，12%分离胶)凝胶电泳，100 V 3 h后蛋白电转移至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭PVDF膜上的非特异性结合位点，加入相应的特异性一抗4 ℃过夜，TBST缓冲液洗PVDF膜3次，加入HRP标记的二抗孵育1 h，使用化学发光试剂盒和X线片。显色目的条带。GAPDH作为内参照蛋白，以显示相同的蛋白上样量。

2 结 果

2.1 氧化苏木素对人肺癌A549细胞的抗肿瘤活性 MTT细胞毒实验结果显示，氧化苏木素对人肺癌A549细胞具有显著的细胞毒活性，其IC50值为(5.36±0.62) μmol/L，见图1。

图1 氧化苏木素对人肺癌A549细胞的细胞毒作用

2.2 氧化苏木素对人肺癌A549细胞的致凋亡作用 Annexin V/PI双染流式细胞仪检测显示氧化苏木素诱导了肺癌A549细胞的凋亡，见图2。从表2可见0、5、10、20 μmol/L的氧化苏木素作用肺癌A549细胞48 h后，细胞凋亡率分别为(1.15±0.32)%、(19.61±4.52)%、(30.18±6.35)%和(39.48±7.44)%，各浓度间差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

图2 氧化苏木素诱导了肺癌A549细胞凋亡

表1 氧化苏木素对肺癌A549细胞的致凋亡作用

2.3 氧化苏木素对肺癌A549细胞内质网应激(ERS) 通路的影响 从图3可见5、10和20 μmol/L氧化苏木素作用肺癌A549细胞48 h后，与对照比较GRP78出现显著的升高(图3A)，细胞质中的cyto-c也出现了显著的增加(图3B)。

A:GRP78;B:cyto-c。

图3 氧化苏木素对肺癌A549细胞GRP78和细胞质cyto-c表达的影响

3 讨 论

随着现代化学分离鉴定技术的进步，大量的小分子化合物从我国传统中药中分离鉴定出来，氧化苏木素是从苏木提取物中分离的一个单体成分，笔者前期在乳腺癌上的研究显示其可以显著抑制乳腺癌的生长[2]，Hsieh等[3]的研究也发现了氧化苏木素可以抑制肿瘤细胞的侵袭和转移。本研究使用氧化苏木素处理人肺癌A549细胞，MTT细胞毒实验显示了氧化苏木素对人肺癌细胞具有显著的毒性作用，进一步的凋亡流式细胞仪分析显示氧化苏木素诱发了人肺癌细胞凋亡的产生，并且呈现剂量依赖性。

细胞凋亡途径主要有3种:(1)外源性(死亡受体)途径；(2)内源性(线粒体)途径；(3)ERS[4]。ERS近年来逐渐受到学者的关注，内质网是哺乳动物细胞蛋白质、脂类、糖类合成和修饰的重要场所，属于体内比较敏感的膜性细胞器[5]，当体内未折叠蛋白或错误折叠蛋白增加时，就会导致ERS的发生，当ERS状态不能恢复时，就可诱导细胞凋亡发生[6]。迄今研究表明，在多数细胞株ERS促发的凋亡主要是通过内源性线粒体凋亡途径来完成[7-8]。一些结合于内质网的一些分子伴侣蛋白在ERS促发的凋亡中起到主要的调节和促发作用，其中GRP78是通路中一个关键的分子伴侣蛋白[9]，GRP78激活后进一步诱发钙离子进入线粒体，线粒体膜电位改变，使cyto-c外漏释放到胞质，激活下游的caspase级联反应，诱导细胞凋亡的发生[10-11]。本研究Western blot检测显示，ERS中的关键调节分子GRP78表达上调，细胞质中的cyto-c也出现相应的升高，上述结果提示了氧化苏木素处理肺癌A549细胞后激活了ERS，随后经线粒体途径诱导了细胞凋亡的发生。

综上所述，氧化苏木素通过ERS途径诱导了人肺癌A549细胞凋亡，具有开发为抗肺癌新药的前景，但其体内的抗肿瘤活性及药物的毒性还有待进一步的研究。

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Brazilein induced cells apoptosis in human lung cancer A549 cells and its effects on endoplasmic reticulum stress*

TaoLiyang1,LiJianying2,ZhangJianye3

(1.DepartmentofPathology,BasicSchoolofGuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510182,China; 2.DepartmentofNephrology,theFirstAffiliatedHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou,Guangdong510080,China;3.PharmaceuticalCollege,GuangzhouMedicalUniversity,Guangzhou,Guangdong510182,China)

Objective To study the apoptotic effect of brazilein on human lung cancer A549 cells and endoplasmic reticulum stress.MethodsThe cytotoxic activity was tested by MTT assay in A549 cells.The flow cytometry was used to detect apoptosis.Western blotting was performed to detect GRP78 and cyto c protein expression.ResultsThe IC50values of brazilein against A549 cells was (5.36±0.62)μmol/L.After treatment with 0,5,10 and 20 μmol/L brazilein for 48 h,the percent of apoptosis was (1.15±0.32)%,(19.61±4.52)%,(30.18±6.35)% and (39.48±7.44)% respectively.There was significant difference among the different treatment (P<0.05).Compared with control group,the protein expression of GRP78 and cytosolic cyto c was increased after 5,10 and 20 μmol/L brazilein treated for 48 h.ConclusionBrazilein induced apoptosis in human lung cancer A549 cells though endoplasmic reticulum stress pathway.

lung neoplasms;brazilein;A549 cells;endoplasmic reticulum stress

10.3969/j.issn.1671-8348.2015.30.002

国家自然科学基金资助项目(81101781)；广东省中医药局建设中医药强省科研课题(20131273)。

: 陶黎阳(1975-)，博士，副教授，主要从事抗肿瘤药物研发、肿瘤多药耐药的研究。

R73-36

A

1671-8348(2015)30-4180-03

2015-03-08

2015-05-16)