泾渭茯茶化学成分HPLC指纹图谱的研究

张 宁，宛晓春，周 杰，张 梁

(安徽农业大学 茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，安徽 合肥 230036)

泾渭茯茶化学成分HPLC指纹图谱的研究

张 宁，宛晓春，周 杰，张 梁

(安徽农业大学 茶叶生物化学与生物技术教育部重点实验室，安徽 合肥 230036)

【目的】 采用高效液相色谱法(HPLC)建立泾渭茯茶化学成分的指纹图谱，以描述泾渭茯茶化学成分的整体特性。【方法】 利用HPLC法分析26个泾渭茯茶样品的主要化学成分，通过化学对照品，结合HPLC-MS多级质谱裂解规律，指认泾渭茯茶指纹图谱的主要色谱峰。以乙腈-0.4%(体积分数)甲酸水溶液为梯度洗脱系统，在检测波长320 nm、柱温30 ℃、流速1 mL/min条件下，建立泾渭茯茶主要化学成分的指纹图谱。采用中药指纹图谱相似度软件，对泾渭茯茶HPLC指纹图谱进行相似度分析，获取各样品与对照指纹图谱的相似度。【结果】 与对照指纹图谱相比，26个不同类型和批次的泾渭茯茶指纹图谱相似度为0.81～0.94，其中共有峰15个。经过HPLC-MS分析，主要的共有峰分别鉴定为没食子酸、可可碱、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、普洱茶素、表儿茶素没食子酸酯和槲皮素。【结论】 26个批次的泾渭茯茶样品指纹图谱相似度较高。

泾渭茯茶；指纹图谱；化学成分；茶多酚

泾渭茯茶是我国陕西省特有的后发酵黑茶品种[1]。在我国黑茶的生产和贸易历史中，陕西泾阳曾经是茯砖茶的主要加工地区。近年来，随着对陕西茯茶特色工艺的传承和发扬，泾渭茯茶逐渐成为我国西北地区的主要黑茶品种。泾渭茯茶的原料选自陕西汉中地区的茶树成熟叶片，经过堆积陈放之后，加工成为砖茶并“发花”成为泾渭茯茶[2]。由于茯茶的加工过程与其他发酵茶叶不同，因此茯茶含有独特的化学成分[3-5]。其他中国黑茶中也含有一系列特有的化学成分，这类成分属于黑茶后发酵过程中新生成的化合物[6-7]。此外，黑茶的保健功效也受到人们的广泛关注，大量研究报道了黑茶的降脂降糖活性，使得黑茶成为近年来茶叶研究领域的热点[8-10]。

黑茶的化学成分除了来自于茶树植物的原有化学成分之外，还有经过后发酵产生的微生物转化成分[11]。在以往的研究中，绿茶中的儿茶素类成分、红茶的茶黄素类成分作为茶叶质量控制成分备受关注[12]。但是，由于黑茶发酵程度的不同，不同产地黑茶的化学成分差异显著。泾渭茯茶的发酵(发花)过程比普洱熟茶的渥堆发酵程度轻，所以其中仍存在高含量的酯型儿茶素[13]。在黑茶化学成分的研究过程中，如何能够突出黑茶特有的化学成分，同时兼顾茶树植物的原有成分是一个值得思考的问题。指纹图谱主要应用于中药生产加工过程中的质量控制[14-15]。黑茶中的指纹图谱是一种以多成分色谱保留性质为参数，建立复杂茶叶化学成分色谱峰属性的分析方法。为了能够描述泾渭茯茶化学成分的整体特性，本研究通过高效液相色谱法(HPLC)建立泾渭茯茶化学成分的指纹图谱，以茶叶中主要的化学成分为对照，鉴定了其中主要的指纹色谱峰。

1 材料与方法

1.1 材 料

本研究收集的泾渭茯茶样本由陕西苍山茶叶有限公司提供，共包括4个系列，26个不同等级的样品(表1)。样品经过55 ℃烘干后，采用手持式粉碎机粉碎，样品粉碎后过0.175 mm筛，并置于4 ℃冰箱内密封保存。

表1 泾渭茯茶样品的信息Table 1 Details of Jingwei fu tea samples

1.2 仪器与试剂

主要仪器包括Waters 高效液相色谱仪(配有Waters 1525 Binary HPLC 泵、Waters 2707 自动进器)，Waters 2489 UV/Visible 检测器(美国Waters公司)；色谱柱Agilent SB-Aq(4.6 mm×250 mm，5 μm)，并且配Phenomenex保护柱；KQ-500DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；AB104-N 电子分析天平(瑞士Mettler Toledo公司)。主要试剂有乙腈(色谱纯)和甲酸(分析纯)。

1.3 样品的制备

准确称取4份100 mg粉碎茶样置于4 mL离心管中，分别加入1 mL乙酸乙酯、体积分数62.5%的甲醇[16]、甲醇和体积分数95%的乙醇超声提取30 min，取上清液3 000 r/min离心10 min，取上清液用0.22 μm微孔滤膜过滤后，待HPLC分析。

1.4 HPLC条件

色谱条件：流动相A为体积分数0.4%的甲酸水溶液，流动相B为乙腈。梯度洗脱条件：0～5 min 5%～12% B；5～30 min 12% B；30～40 min 12%～16% B；40～50 min 16% B；50～60 min 16%～22% B；60～75 min 22%～29% B；75～90 min 29%～50% B；90～95 min 50% B。检测波长320 nm，柱温30 ℃，流速1 mL/min，进样体积5 μL。梯度洗脱中百分含量均为体积分数。

1.5 HPLC-MS分析

采用安捷伦G6300系列HPLC-MS系统、二极管阵列检测器、LC/MSD离子阱、Xcalibur色谱工作站。液相色谱条件与1.4中色谱条件相同。质谱条件：电喷雾离子源(ESI)；源电压3.5 kV，毛细管温度325 ℃，毛细管电压35 V，壳气压172.375 kPa，辅助气压82.74 kPa；采用全离子扫描方式，扫描范围(质荷比，m/z)100～2 000。以标准化合物对照品作为参照，鉴定共有色谱峰的结构。对于缺少对照品的色谱峰，通过正离子/负离子模式确定色谱峰的分子量。以准分子离子峰为母离子，采用碰撞诱导解离裂解选定母离子，并且对碎片离子峰进行结构分析，推导化合物结构。

1.6 HPLC指纹图谱分析

用中药指纹图谱相似度软件导入泾渭茯茶HPLC图谱AIA原始文件，获取26个批次泾渭茯茶HPLC的共有色谱峰，并且建立对照指纹图谱。以芦丁(保留时间=41.4 min)色谱峰为参照峰，计算其他共有色谱峰与参照峰的相对峰面积。计算共有色谱峰相对峰面积的相对标准偏差(RSD)，作为评价泾渭茯茶HPLC指纹图谱相似度的重要依据。用指纹图谱相似度软件，计算26个批次泾渭茯茶HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的整体相似度。

2 结果与分析

2.1 泾渭茯茶提取方法的优化

参照已有的黄酮类物质提取方法，比较不同溶剂对于泾渭茯茶化学成分的提取效率，结果发现用体积分数62.5%的甲醇提取之后，样品的HPLC色谱峰响应强度高，峰数量多。基于已有文献报道[16]，结合本试验结果，最终确定泾渭茯茶的提取溶剂为体积分数62.5%的甲醇。

2.2 泾渭茯茶指纹图谱的建立

对26个不同批次茶叶样品进行HPLC检测后，用中药指纹图谱相似度评价软件进行计算，得到S1～S26共26个泾渭茯茶样本的指纹图谱(图1)。图1-A为中药指纹图谱相似度评价软件生成的对照指纹图谱，指纹图谱相似度软件辨识出26个批次泾渭茯茶中的15个共有峰。

2.3 泾渭茯茶共有指纹峰的HPLC-MS鉴定

以9号峰的色谱峰作为参比峰，计算各共有指纹峰的相对保留时间、相对峰面积。以色谱峰相对峰面积作为参数，15个主要色谱峰相对峰面积的相对标准偏差(RSD)如表2所示。以标准品的保留时间和质谱信号作为对照，其中9个共有峰分别被鉴定为没食子酸、可可碱、没食子儿茶素、表没食子儿茶素、儿茶素、表儿茶素、普洱茶素、表儿茶素没食子酸酯和槲皮素。此外，以HPLC-MS质谱碰撞诱导解离(CID)信号为依据，还推导出其他2个化合物的结构。

以其中8号和9号色谱峰为代表，通过HPLC-MS质谱CID信号推导其结构的过程，结果如图2所示。

8号峰的准分子离子峰为[M+H]+m/z731.1，[M-H]-m/z729.0，其相对分子质量为730。以[M-H]-m/z729.0为母离子，通过CID信号获得其二级碎片离子m/z603.0(-126/原花青素A环片段)，m/z577.0 (-152/-gallic acid+H2O)，m/z559.0 (-170/-gallic acid)，m/z440.9 (catechin gallate-H)和m/z288.9 (catechin-H)。推断其标志性离子m/z440.9为儿茶素没食子酸酯的准分子离子峰。通过对m/z440.9进行CID信号分析，发现其主要的三级碎片离子峰为m/z288.9(-152/-gallic acid+H2O)。通过对碎片离子的分析，可以推导8号峰化合物含有2×黄烷醇母核、1×没食子酸基团，推导其可能的结构如图2所示。

9号峰的准分子离子峰为[M+Na]+m/z795.2，[M-H]-m/z771.1，其相对分子质量为772。以[M-H]-m/z771.1为母离子，通过分析CID信号获得其二级碎片离子m/z609.0 (-162/-glucose+H2O)，m/z462.9 (-162-146/-glucose-rahmnose+2H2O)，m/z300.8 (-162-146-162/-glucose-rahmnose-glucose+3H2O)。通过对碎片离子的分析，可以推导9号峰化合物含有黄酮苷元母核(槲皮素)、2×葡萄糖基团和1×鼠李糖基团，推导其可能的结构如图2所示。

图1 26泾渭茯茶样品的HPLC指纹图谱A.对照；B.S1～S26

表2 泾渭茯茶15个共有峰的化学结构鉴定Table 2 Identification of shared HPLC peaks of Jingwei fu tea samples

续表2 Continued table 2

注：*“+”表示有，“-”表示无。

Note:“+” means exist,“-” means no exist.

图2 泾渭茯茶指纹图谱中8号和9号色谱峰的质谱裂解碎片解析

2.4 泾渭茯茶指纹图谱的相似度

通过中药指纹图谱相似度评价软件，分别将26个泾渭茯茶HPLC色谱图与对照指纹图谱进行相似度分析，结果见表3。由表3可知，泾渭茯茶样本的指纹图谱相似度为0.81～0.94。从指纹图谱(图1)中可以看出,各个系列的泾渭茯茶样品都具有相同的主成分峰, 但是峰面积比值不尽相同。结果提示不同年份、不同等级和不同工艺的茶叶样本，主要成分的含量存在一定差异。

表3 泾渭茯茶HPLC指纹图谱与对照指纹图谱的相似度Table 3 Similarities of HPLC fingerprints of Jingwei fu tea samples with reference fingerprints

3 讨 论

通过对样品提取方法的优化，使泾渭茯茶主要化学成分的色谱分离度达到了指纹图谱的基本要求。为了能够尽可能多地获得泾渭茯茶中化学成分的HPLC-UV信号，前人比较了280与320 nm波长的检测效果，虽然280 nm检测波长下主要的多酚(儿茶素)成分能够得到较好的响应，但是其他含量较低的黄酮类化合物信号较差[17]，故本研究最终选择320 nm波长进行检测。本研究收集的泾渭茯茶样本属于不同年份、不同等级和不同工艺的样本，所以不同样本之间主要成分的含量存在一定差异。对泾渭茯茶指纹图谱进行分析共获得了相关的15个共有色谱峰，这些色谱峰不仅包括了茶叶原料中高含量的酯型儿茶素，还有黄酮和黄酮苷以及黑茶后发酵过程中特有的儿茶素微生物转化产物，系统而全面地反映了泾渭茯茶化学成分的特点。

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HPLC fingerprints of chemical constituents of Jingwei fu tea

ZHANG Ning,WAN Xiao-chun,ZHOU Jie,ZHANG Liang

(KeyLaboratoryofTeaBiochemistryandBiotechnology,MinistryofEducation,AnhuiAgriculturalUniversity,Hefei,Anhui230036,China)

【Objective】 This study investigated the fingerprint of Jingwei fu tea using high performance liquid chromatography (HPLC).【Method】 With the gradient elution of HPLC,the main chemical constituents of Jingwei fu tea were analyzed and identified by reference chemicals and HPLC-MS.The gradient elution phase containing acetonitrile and 0.4% formic acid were used to separate the main chemical constituents of Jingwei fu tea at the wavelength of 320 nm,temperature of 30 ℃ and elution ratio of 1 mL/min.The HPLC fingerprints of 26 Jingwei fu tea samples were analyzed by Traditional Chinese medicine (TCM) fingerprint similarity calculation software.【Result】 The similarities of 26 samples with different types and batches were in the range of 0.81-0.94 compared with the control HPLC fingerprint generated by TCM fingerprint similarity calculation software.Fifteen shared peaks of HPLC fingerprints were analyzed by HPLC-MS.Nine of these peaks were identified as gallic acid,theobromine,gallocatechin,epigallocatechin,catechin,epicatechin,puerins,epicatechin gallate and quercetin.【Conclusion】 The fingerprints of 26 Jingwei fu tea samples were highly similar.

Jingwei fu tea;fingerprint;chemical constituents;tea polyphenols

时间:2015-08-05 08:56

10.13207/j.cnki.jnwafu.2015.09.015

2014-02-21

国家自然科学基金青年项目(31201335)；安徽省自然科学基金青年项目(1308085QC51)

张 宁(1989-)，女，山东泰安人，在读硕士，主要从事茶叶化学成分及功效研究。E-mail：zning7@163.com

张 梁(1985-)，男，江西彭泽人，副教授，主要从事茶叶化学成分及功效研究。E-mail：zhli2091@sina.com

S571.1;TS201.2

A

1671-9387(2015)09-0103-06

网络出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/61.1390.S.20150805.0856.030.html