高效液相色谱法测定感冒热毒清合剂中绿原酸的含量

2015-01-07邹晓华陈明洁解放军第7医院药剂科浙江杭州3003浙江省中医药研究院中药研究中心浙江杭州30007

中国医院用药评价与分析 2015年8期

邹晓华，陈明洁，方琅，张扬(.解放军第7 医院药剂科，浙江杭州 3003;.浙江省中医药研究院中药研究中心，浙江杭州 30007)

感冒热毒清合剂(南制字2011F19001)为解放军第117 医院(以下简称“我院”)结合长年的临床实践，并进行处方筛选，研制成的质量稳定、作用快、疗效好、治疗感冒的纯中药制剂，具有清热解毒，抗菌消炎等功效，用于治疗流行性感冒，上呼吸道感染，扁桃腺炎，咽喉炎等各种疾病。该合剂由金银花、板蓝根、连翘等组成。其中，金银花有“中药中的抗菌素”之称，可清热解毒、疏散风热，多用于痈肿疔疮，喉痹，丹毒，热毒血痢，风热感冒，温病发热［1］等证，而绿原酸为金银花的主要成分之一。目前，感冒热毒清合剂质量标准中有性状、鉴别、检查等检验项目，但尚未建立组方中主要成分绿原酸的含量测定方法［2］。本研究选取金银花中绿原酸为指标成分，为了更好地控制本品质量，采用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)对感冒热毒清合剂中绿原酸的含量进行测定。

1 材料

1.1 仪器

高效液相色谱仪LC-20A 型(日本岛津)、电子天平AE240(瑞士METTLER)、HH-S 数控恒水浴锅(金华市文华科教实验仪器厂)、KQ-400DB 型数控超声清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂

绿原酸对照品(中国食品药品检定研究院，批号:110753-201314);感冒热毒清合剂供试品(解放军第117 医院制剂室，批号:20140218、20131220、20140401、20140117、20131024);正丁醇为分析纯(天津市永化化学试剂有限公司，批号:20120507)，氨水为分析纯(浙江三鹰化学试剂有限公司，批号:20130901)。甲醇、乙腈均为色谱纯(德国MERCK 公司，批号:20140114)。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

绿原酸的色谱条件:色谱柱为SHISEIDO CAPCELL PAK MG-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈-0.4%磷酸(V ∶V =88 ∶12)，检测波长327 nm，流速为1.0 ml/min，柱温40 ℃，理论板数按绿原酸峰计算，应不低于1 000。

2.2 溶液的配制

2.2.1 对照品溶液制备:精密称取绿原酸对照品10.04 mg，加入至25 ml 棕色容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容至刻度，即为绿原酸对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液制备:取感冒热毒清合剂样品25 ml，加入到50 ml 棕色容量瓶中，加甲醇至刻度，超声提取30 min，冷却后，用甲醇补足体积，作为绿原酸含量测定的供试品溶液。

2.2.3 阴性对照溶液制备:按处方组分比例及工艺制备要求，制成不含金银花的阴性对照溶液适量，按供试品溶液制备方法制成阴性对照溶液。

2.3 专属性考察

分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液及阴性对照品溶液各20 μl 注入液相色谱仪，测定，结果阴性对照品溶液在绿原酸峰相应的保留时间附近无干扰峰出现，见图1。

图1 绿原酸、感冒热毒清合剂及阴性对照品HPLC 图Fig 1 HPLC chromatogram of reference substance of chlorogenic acid，GMRDQ mistura and negative reference substance

2.4 线性关系考察

精密量取绿原酸对照品溶液，进行梯度稀释，注入液相色谱仪各10 μl，记录绿原酸峰面积。以绿原酸质量浓度(X)为横坐标，绿原酸峰面积(Y)为纵坐标，进行线性回归，得回归方程:Y=230 09X+516 45，r=0.999 5。结果表明，绿原酸对照品浓度在5.02 ～100.4 μg/ml 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.5 精密度试验

精密吸取绿原酸对照品溶液10 μl，重复进样5 次，测定峰面积。结果显示，平均峰面积的RSD=0.99%，表明仪器精密度良好。

2.6 稳定性试验

取批号为20131220 的感冒热毒清合剂，按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，分别于常温条件放置0，4，8，12，24 h后，分别进样20 μl，记录绿原酸峰面积。结果显示，RSD=1.45%，表明供试品溶液至少在24 h 内基本稳定。

2.7 重现性试验

照“2.2.2”项下方法，将同一批次，批号为20131220 样品平行制备5 份供试品溶液，分别测定绿原酸的含量，结果显示，RSD=1.30%，表明方法重现性良好。

2.8 加样回收率试验

取已知含量的感冒热毒清合剂适量，共6 份，每份10 ml，分别精密加入高、中、低浓度的绿原酸对照品溶液，置25 ml 棕色容量瓶中，用甲醇补足体积。按“2.2.2”项下方法操作，测定并计算绿原酸的加样回收率，结果见表1。

表1 绿原酸加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery test on chlorogenic acid

2.9 样品含量测定

取感冒热毒清合剂4 批样品(批号:20140218、20131220、20140401、20140117、20131024)，按2.2.2项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，精密吸取20 μl，注入HPLC 仪中进行绿原酸含量测定，结果见表2。

表2 感冒热毒清合剂样品含量测定结果Tab 2 Determination results of contents of GMRDQ mistura samples

3 讨论

感冒热毒清合剂组方中主要成分为金银花。研究结果显示，金银花提取物及其所含的化学成分具有多种药理活性，包括抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化、保肝、抗肿瘤等。针对该制剂探求金银花的质量标准研究，建立一种有效的检测方法，对严格把控制剂质量具有重要意义［3］。

感冒热毒清合剂成分复杂，在供绿原酸含量测定用的供试品溶液制备过程中，因绿原酸不稳定性和见光分解的特性，采用甲醇为提取溶剂，并在棕色瓶中保存，提取效率高［4-5］。大量研究结果显示［6-13］，金银花药材的质量受到产地、气候、生态环境、采收期和加工方法等因素的影响。不同批号的样品由于原材料产地、采集时节不同，存放时间及条件不同，对合剂中的绿原酸含量有较大的影响。因此，该合剂的质量控制应严格从源头抓起，即严格把握原药材的质量。另外，金银花中的绿原酸是一种极不稳定的成分，在提取、灌装及保存过程中应注意闭光，并使用深色容器。

课题组前期已对于感冒热毒清合剂中的连翘苷和绿原酸进行定性鉴别，但尚未建立绿原酸的含量测定方法。本研究建立了金银花中绿原酸指标成分的含量测定方法，该方法结果准确，重复性好，可作为医院制剂-感冒热毒清合剂的质量评价方法［14-15］。

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