高效液相色谱法测定前列回春丸中虎杖苷的含量

张 红 ，饶俊珍，程 璐(武汉市第一医院药学部，湖北 武汉 430022)

前列回春丸是在前列回春胶囊的基础上进行剂型改革而进一步研发的新制剂，为浓缩水丸，主要由虎杖、淫羊藿、炮山甲等19 味中药组成，具有益肾回春、活血通淋、清热解毒的功效。虎杖为方中主药之一，虎杖苷为其专属性指标成分，本研究采用高效液相色谱法 (high performance liquid chromatography，HPLC)测定前列回春丸中虎杖苷的含量，为该制剂质量标准的制定提供依据。

1 仪器与试剂

岛津LC-10AT 型HPLC 仪、岛津液相色谱仪紫外检测器SPD-10A(日本岛津公司)，浙大N2000 色谱工作站;KQ-300DE型数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。前列回春丸供试品共9 批(规格:每8 丸相当于原生药3 g;批号:131201、131202、131203、140101、140102、140103、140301、140302、140303);虎杖苷对照品(中国药品生物制品检定所提供，含量测定用，批号:111575-200301);乙腈为色谱纯，水为重蒸水。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

取经五氧化二磷为干燥剂，减压干燥24 h 的虎杖苷对照品适量，精密称定，加入稀乙醇制成每1 ml 含17.39 μg 的溶液，摇匀，即得。

2.2 供试品溶液制备

取本品20 丸，研细，取细粉约1.5 g，精密称定，置于50 ml具塞棕色锥形瓶中，加入稀乙醇25 ml，密塞，精密称定，超声处理(300 W，40 kHz)30 min，室温［(25 ±2)℃］下放置，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，过滤，取续滤液，即得。

2.3 阴性对照溶液制备

按处方量称取除虎杖外的所有组分，制备虎杖阴性对照样品，同“2.2”项下方法操作，即得。

2.4 色谱条件

色谱柱:Hypersil ODS2Cl8柱(4.6 mm×250 mm，5μm);检测波长:306 nm;流动相:乙腈-水(V∶V=19∶81);柱温:30 ℃;流速:1 ml/min;灵敏度:0.08 AUFS;理论板数按虎杖苷峰计算不低于3 000;避光操作。

2.5 专属性验证

分别取对照品、供试品、阴性对照溶液各20 μl，在“2.4”项的色谱条件下进样，记录色谱图。结果显示，虎杖苷色谱峰峰形对称，供试品色谱图中虎杖苷峰能与其他成分很好地分离，阴性对照溶液在虎杖苷峰处基本无干扰，见图1。

图1 HPLC 图Fig 1 HLPC chromatograms

2.6 精密度考察

精密吸取对照品溶液及供试品溶液分别连续进样6 次，每次20 μl，峰面积RSD分别为0.78%、1.63%。

2.7 线性关系考察

精密称取经五氧化二磷为干燥剂，减压干燥24 h 虎杖苷对照品7.88 mg，置于20 ml 棕色量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀;精密吸取10 ml 置于100 ml 棕色量瓶中，加稀乙醇至刻度并摇匀;精密吸取1、3、5、7、9、11、13、15 ml 分别置于20 ml 棕色量瓶中，加稀乙醇至刻度并摇匀，按色谱条件分别精密吸取20 μl 注入HPLC 仪，以注入的虎杖苷浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)，作图得到标准曲线，回归方程为Y=10 367X-745.02，r=0.999 8。结果显示，虎杖苷质量浓度在1.97 ～29.55 μg/ml 范围内与峰面积呈良好的线性关系。

2.8 稳定性试验

精密吸取供试品(批号:140101)溶液20 μl，分别在0、4、8、12、24 h 测定虎杖苷的峰面积。结果显示，供试品溶液中被测成分在24 h 内基本稳定，RSD为1.94%。

2.9 重复性试验

取前列回春丸(批号:140101)6 份，按“2.2”项下方法制备溶液，精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl 注入HPLC 仪，测定。结果显示，虎杖苷含量平均值为128.1 μg/g，RSD为1.10%。

2.10 加样回收率试验

称取前列回春丸(批号:140101)6 份，每份20 丸，研细，取细粉约0.75 g，精密称定，精密加入同一浓度的虎杖苷对照品溶液1 ml(取虎杖苷9.92 mg 置于100 ml 棕色量瓶中，加稀乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀)，余按“2.2”项下方法制备供试品溶液，测定并计算供试品中虎杖苷的回收率，结果见表1。

表1 加样回收率试验结果Tab 1 Results of recovery tests

2.11 供试品含量测定

取前列回春丸9 批，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20 μl，注入HPLC 仪，测定，结果见表2。

表2 供试品虎杖苷含量测定结果(n=2)Tab 2 Results of determination of contents in the samples of polydatin(n=2)

3 讨论

3.1 供试溶液制备方法的选择

文献报道，供试溶液制备中所用的溶剂有甲醇［1-3］、稀乙醇［4-15］。采用这2 种溶剂进行试验的结果表明，用甲醇作为溶剂时，除虎杖苷峰外，其他峰数相对小和少，但从环保考虑，在分离度能达到要求的前提下，选取稀乙醇为佳。文献报道，供试溶液制备中所用的处理方法主要有超声［1-11］与回流［12-15］。超声处理方法较简便，且有实验研究结果表明，采用超声提取法虎杖苷的含量高于［3-6］或等于［7-9］回流提取。因此，本研究采用超声处理方法，并比较15、20、30、40 min 的超声时间与成分提取的关系，结果表明，超声30 min 已能充分提取出样品中的虎杖苷，故拟定超声时间为30 min。

3.2 检测波长及流动相的选择

参考《中华人民共和国药典》等文献，选定检测波长为306 nm、流动相为乙腈-水［1-4，7-15］。调整流动相比例为19∶81(V∶V)时，虎杖苷峰能与其他成分峰达到有效分离，分离度较好，色谱系统稳定。该色谱系统的重复性和精密度均好，适用于前列回春丸中虎杖苷的定量分析。

综上所述，HPLC 法测定前列回春丸中虎杖苷的含量，操作方便、专属性强，可作为前列回春丸的质量控制方法之一。

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